איתור ובידוד של קמפילובקטר spp. מבשר נא

Summary

קמפילובקטר הוא הגורם המוביל לדלקת גסטרואנטריטיס חיידקית המועברת במזון ברחבי העולם. למרות שמפעלים נוקטים צעדים להפחתת השכיחות בכל המתקנים שלהם, מוצרים מזוהמים מגיעים באופן עקבי לצרכנים. הטכניקה שפותחה בשתים עשרה השנים האחרונות נותנת מענה למגבלות של השיטות הקיימות לבידוד וגילוי קמפילובקטר spp. מבשר נא.

Abstract

מאמר זה מציג פרוטוקול מהיר אך חזק לבידוד קמפילובקטר spp. מבשר נא, תוך התמקדות ספציפית בקמפילובקטר ג’ג’וני וקמפילובקטר קולי. הפרוטוקול מתבסס על שיטות מבוססות, ומבטיח תאימות לטכניקות הרווחות על ידי גופים רגולטוריים כגון מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) ומשרד החקלאות האמריקאי (USDA) בארה”ב, כמו גם ארגון התקינה הבינלאומי (ISO) באירופה. במרכז פרוטוקול זה עומד איסוף שוטף, אשר מרוכז ומושהה מחדש במדיה של מרק בולטון המכילה דם סוס. מדיום זה הוכח כמקל על התאוששות תאי קמפילובקטר בסטרס ומקצר את משך ההעשרה הנדרש ב -50%. הדגימות המועשרות מועברות לאחר מכן לקרומי ניטרוצלולוז על לוחות ברוסלה. כדי לשפר את הרגישות והספציפיות של השיטה, הוערכו קרומי מסנן בגודל נקבוביות של 0.45 מיקרומטר ו- 0.65 מיקרומטר. הנתונים חשפו עלייה של פי 29 בשחזור התאים עם מסנן בגודל נקבוביות של 0.65 מיקרומטר בהשוואה לגודל נקבוביות של 0.45 מיקרומטר מבלי להשפיע על הספציפיות. המאפיינים התנועתיים מאוד של קמפילובקטר מאפשרים לתאים לנוע באופן פעיל דרך מסנני הממברנה לכיוון תווך האגר, המאפשר בידוד יעיל של מושבות קמפילובקטר טהורות. הפרוטוקול משלב בדיקת תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (mqPCR) כדי לזהות את המבודדים ברמת המין. טכניקה מולקולרית זו מציעה אמצעי אמין ויעיל לזיהוי מינים. חקירות שנערכו במהלך שתים עשרה השנים האחרונות הקשורות לבשר קמעונאי הוכיחו את יכולתה של שיטה זו לשפר את ההתאוששות של קמפילובקטר מדגימות בשר מזוהמות באופן טבעי בהשוואה לשיטות הייחוס הנוכחיות. יתר על כן, פרוטוקול זה מתגאה בזמן הכנה ועיבוד מופחת. כתוצאה מכך, הוא מציג חלופה מבטיחה להתאוששות יעילה של קמפילובקטר מבשר. יתר על כן, הליך זה יכול להיות משולב בצורה חלקה עם שיטות מבוססות DNA, המאפשר סינון מהיר של דגימות חיוביות לצד ניתוח ריצוף גנום שלם מקיף.

Introduction

קמפילובקטר spp. הם הגורם המוביל לגסטרואנטריטיס חיידקית המועברת במזון ברחבי העולם, עם הערכה של 800 מיליון מקרים בשנה¹. כחיידק זואונוטי עיקרי, קמפילובקטר מאכלס באופן טבעי את מערכת העיכול של מגוון רחב של בעלי חיים, כולל ציפורי בר, חיות משק וחיות מחמד². במהלך שחיטה או עיבוד מזון, קמפילובקטר spp. לעתים קרובות לזהם פגרים או מוצרי בשר³. קמפילובקטריוזיס קשורה בדרך כלל לצריכת עופות לא מבושלים או זיהום צולב של מזונות אחרים על ידי מיצי עוף גולמיים². זה יכול לגרום לסיבוכים חמורים, כגון תסמונת Guillain-Barré, דלקת מפרקים תגובתי, אלח דם אצל אנשים מדוכאי חיסון⁴. איתור ובידוד קמפילובקטר ממקורות מזון, במיוחד מוצרי עוף, חיוני למעקב אחר בריאות הציבור, חקירת התפרצויות והערכת סיכונים.

שיטות קונבנציונליות מבוססות תרבית הן השיטות המסורתיות והסטנדרטיות לזיהוי קמפילובקטר ^5,6. עם זאת, ישנן מספר מגבלות, כולל זמני דגירה ארוכים (48 שעות או יותר), רגישות נמוכה (עד 50%), והן אינן כוללות את כל הזנים (חלק מתאי הקמפילובקטר בסטרס עשויים שלא לגדול היטב או בכלל בתקשורת)⁷. שיטות מולקולריות, כגון תגובת שרשרת פולימראז (PCR), מהירות ורגישות יותר משיטות מבוססות תרבית, אך הן אינן מספקות מבודדים בני קיימא לאפיון נוסף ^8,9.

שיטות אימונולוגיות הן שיטות חלופיות ומשלימות לזיהוי קמפילובקטר . אלה מהירים, פשוטים ורב-תכליתיים, אך יש להם גם מספר מגבלות, כולל תגובתיות צולבת (נוגדנים מסוימים עשויים להיקשר לחיידקים שאינם קמפילובקטר או לחומרים אחרים החולקים אנטיגנים דומים), ספציפיות נמוכה (נוגדנים מסוימים עשויים שלא להיקשר לכל זני הקמפילובקטר או הסרוטיפים), ודרישות להכנת הדגימות (שיטות אימונולוגיות דורשות לעתים קרובות טיפול מקדים בדגימות כדי להסיר חומרים מפריעים כדי להגביר את קשירת הנוגדנים)¹⁰.

בסוג קמפילובקטר, C. jejuni ו-C. coli גורמים לרוב זיהומי הקמפילובקטר בבני אדם (81% ו-8.4%, בהתאמה)¹¹. שניהם חיידקים בצורת ספירלה, מיקרו-אירופיליים ותרמופיליים המכילים שוטון חד-קוטבי או שוטון דו-קוטבי. סיבוב של שוטון בכל קוטב נחשב הן לכוח המניע העיקרי לתנועתיות הפקקים האופיינית שלו והן חיוני לפתוגנזה שלו מכיוון שהוא מאפשר לחיידק לשחות דרך הרירית הצמיגה של מערכת העיכול המארחת. תנועתיות הקמפילובקטר נשלטת על ידי המערכת הכימו-חושית שלו המאפשרת לתאים לנוע לעבר סביבות נוחות^12,13. בהתבסס על המורפולוגיה של התא והמאפיינים הפיזיולוגיים של קמפילובקטר, מספר מחקרים השתמשו בסינון קרום לבידוד של קמפילובקטר spp. מדגימות צואה וסביבה 14,15,16.

מחקר זה מציג פרוטוקול מהיר וחזק לבידוד וגילוי עוקב של C. jejuni ו – C. coli מבשר נא, המתגבר על חסרונות השיטות הקיימות ומציע מספר יתרונות. ניתן לאשר מושבות טנטטיביות כקמפילובקטר spp. באמצעות מגוון שיטות, כגון מיקרוסקופיה, בדיקות ביוכימיות (למשל, מבחני פעילות קטלאז ואוקסידאז), או שיטות מולקולריות⁶. השיטה מזהה את המבודדים ברמת המין באמצעות בדיקת PCR בזמן אמת (mqPCR) המכוונת לגנים ייחודיים ל – C. jejuni ו – C. coli. שיטה זו זולה, מהירה וסלקטיבית יחסית, מה שהופך אותה למתאימה לשימוש במגוון מסגרות, כולל מתקני עיבוד מזון, מעבדות קליניות ומעבדות מחקר.

Protocol

כל העבודה הקשורה לפרוטוקול זה צריכה להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגי (BSC) כדי לשמור על תנאים אספטיים ולמזער את הסיכון לזיהום דגימה או לחשיפת מפעיל לפתוגנים מיקרוביאליים. בעת העברת דגימות מחוץ ל- BSC, השתמש במיכלים אטומים כדי למנוע שפיכה במקרה של נפילות בשוגג, תוך שמירה על שלמות הדגימה. רצוי להשתמש ברכיבים חד פעמיים לאורך כל ההליך כדי לצמצם את האפשרות של זיהום צולב. במקרים בהם אין אפשרות לשימוש חד פעמי, יש לוודא שכל הציוד והחומרים סטריליים לפני השימוש. ניהול נכון של פסולת הוא חיוני; יש להשליך את כל הרכיבים החד-פעמיים המשומשים כפסולת מסוכנת ביולוגית. חומרים אוטוקלאביים לפני השלכתם כדי להבטיח עיקור נאות ולהימנע מהכלה של חומרים שעלולים להיות מסוכנים. הקפדה על אמצעי זהירות אלה לא רק שומרת על שלמות הדגימה, אלא גם ממזערת את הסיכון לחשיפת המפעיל לפתוגנים מיקרוביאליים. איור 1 מתאר את זרימת העבודה של הכנת דגימות, העשרה סלקטיבית, בידוד מבוסס מסנן והתמיינות mqPCR של מיני קמפילובקטר . קובץ משלים 1 מתאר תהליך עבודה מפורט יותר ותמונות לאורך כל התהליך. 1. הכנת דגימות בשר רכישת דגימות בשררכשו חבילות בשר טרי שונות, כולל ירכי עוף, כנפיים, מקלות תיפוף וכבדים מקמעונאים מקומיים. העבירו את כל הדגימות לאחסון בטמפרטורה של 4°C ועבדו תוך 24 שעות לאחר קבלתן.הערה: אחסון הדגימות הטריות בטמפרטורות נמוכות יותר, כגון מתחת לאפס, ישפיע על ההתאוששות. עיבוד דגימות בשרעקוב אחר יחס הרכיבים שנקבע בהנחיות הדגימה של FSIS 6,17. חותכים 450 גר’ חתיכות עוף מכל אריזה ומניחים אותן בשקית קיבה (ראו טבלת חומרים).הערה: שקיות קיבה מוצעות מכיוון שיש להן חוזק מכני מספיק כדי להבטיח את התהליכים במורד הזרם, והן לא יקרעו או ידלפו. הכינו מי פפטון חוצצים (BPW).יש להמיס 20 גרם של האבקה (ראו טבלת חומרים) בליטר אחד של מים מטוהרים. Autoclave את התמיסה ב 121 ° C במשך 15 דקות. מדללים את התמיסה במים סטריליים לריכוז של 0.1%. מוסיפים 200 מ”ל 0.1% BPW לשקית הקיבה המכילה את העוף. יש לעסות/למשש ידנית את הדגימה מהצד החיצוני של שקית הבטן למשך 2 דקות. אספו את כל שטיפת העוף מהצד המסונן של השקית באמצעות בקר פיפטה ממונע (ראו טבלת חומרים). מוציאים את שטיפת העוף לבקבוקי צנטריפוגות סטריליים. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. אספו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות בקר פיפטה ממונע עם פיפטת פלסטיק סרולוגית חד פעמית בנפח 25 מ”ל. הימנע מלהפריע לכדור. חזור על התהליך לפי הצורך כדי לוודא שכל הסופרנאטנט מוסר. השליכו את הסופרנטנט שנאסף. 2. העשרה סלקטיבית של קמפילובקטר מבשר נא הכנת מרק בולטון עם תוספי מזוןיש להמיס 13.8 גרם אבקה (ראו טבלת חומרים) ב-500 מ”ל מים מטוהרים. לעקר את המרק על ידי autoclaving במשך 15 דקות ב 121 ° C. הוסף 25 מ”ל דם סוס לאק (ראה טבלת חומרים) למרק בולטון מעוקר 500 מ”ל.הערה: תוספת של דם סוס פועלת כחומר מרווה חמצן כדי לסייע בהתאוששות של תאי קמפילובקטר פצועים ממטריצת המזון. לבנות מחדש בקבוקון 1 של תוסף אנטיביוטי (cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, ו vancomycin, ראה טבלה של חומרים) ב 5 מ”ל 50% אתנול. הוסיפו את תוסף האנטיביוטיקה המחודש למרק בולטון. הליך העשרהיש להשהות את הגלולה במרק בולטון במינון 50 מ”ל המכיל דם סוס ואנטיביוטיקה. הניחו דגימות (עם מכסים רופפים) בתוך מיכל אטום השומר על תערובת גז של 85% N2, 10% CO2 ו-5% O2.ודא שהמכסה רופף, אך המיכל אטום היטב כדי לייצר את דרישות הגידול המיקרואירופיליות והתרמופיליות של קמפילובקטר.הערה: ניתן להשתמש בחבילות גז השומרות על אטמוספירה של 85% N2, 10% CO2 ו- 5% O2 כאשר תאים סביבתיים אינם זמינים. לדגור את הדגימות ב 42 ° C במשך 24 שעות. 3. בידוד וטיהור של C. jejuni ו – C. coli מעוף נא הכנת צלחות אגר ברוסלהיש להמיס 28 גרם אבקת ברוצלה (ראו טבלת חומרים) בליטר אחד של מים מטוהרים. ממיסים 15 גרם אגר בתמיסת הברוסלה. לעקר את אגר Brucella על ידי autoclaving במשך 15 דקות ב 121 ° C. מצננים את תערובת האגר הבינונית באמבט מים בטמפרטורה של 55°C. יוצקים 20 מ”ל של אגר Brucella לתוך כל צלחת פטרי בקוטר 100 מ”מ. שיטת סינון וטיפוח מושבהלהעריך את ההשפעה של לחות על קמפילובקטר עובר דרך מסננים על ידי ייבוש לוחות אגר Brucella עם מכסים פתוחים בארון בטיחות ביולוגית במשך 0 שעות, 1 שעות, 2 שעות ו 3 שעות. הכינו בקרה ללא סינון על ידי פיזור ישיר של 80 μL של הדגימה על צלחת אגר Brucella. הניחו מסנן תאית אצטט (0.45 מיקרומטר או 0.65 גודל נקבוביות, ראו טבלת חומרים) במרכז צלחת אגר Brucella. פיפטה 4 טיפות/פילטר ו-20 מיקרוליטר/טיפה של דגימה מועשרת על המסנן.הניחו את הטיפות קרוב למרכז הפילטר כדי לוודא שהנוזל שמגיע לצלחת עובר דרך המסנן, ולא מסביב לפילטר. הניחו את הטיפות באופן שיבטיח שהן לא יתפשטו ויצטברו. דוגרים טיפות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ומסירים בזהירות את המסננים.הערה: שלב זה מאפשר מספיק זמן לתאי הקמפילובקטר לחצות את הממברנה ולהגיע למדיום האגר ללא ייבוש יתר. דגירה על צלחות ב 42 ° C במשך כ 24 שעות בתנאים מיקרואירוביים שתוארו קודם לכן. בחר מושבות קמפילובקטר אופייניות עם תכונות ספציפיות.הערה: מושבות קמפילובקטר הן בדרך כלל עגולות עם קצוות חלקים, נוצצים וצבע צהבהב או ורדרד שקוף6. פסים מושבות על צלחות אגר Brucella לטיהור. חזור על שלב זה עד לקבלת לוחות עם מורפולוגיית מושבה אחידה אחת. הכינו דוגמאות לאחסון לטווח ארוך.הכינו מרק בולטון כפי שתואר קודם לכן. מוסיפים מושבה אחת מהצלחת עם מורפולוגיית מושבה אחידה. לגדול בן לילה (24 שעות) בתנאים מיקרואירופיליים שתוארו קודם לכן. הוסף 900 μL של תרבית לילה לקריביאל 2 מ”ל המכיל 100 μL של DMSO. מצננים במהירות באמבט קרח-אתנול יבש (כ-72°C) למשך 10 דקות. מעבירים למקפיא בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך. 4. זיהוי המינים C. jejuni ו-C. coli בצע זיהוי ברמת המין של C. jejuni ו- C. coli באמצעות בדיקת qPCR (mqPCR) מרובת משתתפים שפותחה בעבר18,19.בצע ליזה מהירה של התא ומיצוי DNA גנומי בפורמט צלחת של 96 בארות.הערה: מומלץ מאוד לשקול שימוש בערכות מסחריות (ראה טבלת חומרים) כדי להבטיח שהדגימה נקייה מספיק ממעכבי PCR ידועים.פזרו מושבות קמפילובקטר מטוהרות לתוך 100 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי. ליז דוגם ב 99 ° C במשך 10 דקות ואחריו קירור ב 20 ° C במשך 2 דקות thermocycler. צנטריפוגה את הצלחת ב 8,000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר 2 μL של aliquots של supernatant עבור בדיקת mqPCR. הכינו תערובת תגובה של 20 μL המורכבת מ-10 μL של 2x Master Mix, 2.0 μL של דגימת DNA, 104 עותקים של תבנית Internal Amplification Control (IAC) ו-200 ננומטר של כל פריימר ובדיקה (ראו טבלת חומרים).הערה: הפריימרים והבדיקות של hipO ו-cdtA הם גני המטרה הבלעדיים עבור C. jejuni ו-C. coli, בהתאמה. ה- IAC מורכב ממקטע DNA של 79 bp של נגיף האדנו האנושי ונכלל כבקרה חיובית כדי להבטיח פעילות עקבית של DNA פולימראז בכל הדגימות. טען את כל הדגימות בטריפליקטים בלוח אופטי בן 96 בארות המכוסה בסרט אופטי ומקם אותן במערכת PCR בזמן אמת (ראה טבלת חומרים).התחל הפעלה חמה של DNA פולימראז ב 95 ° C במשך 10 דקות. לאחר מכן יש לבצע 40 מחזורים של דנטורציה ב-95°C למשך 15 שניות וחישול/הארכה ב-60°C למשך דקה אחת. 5. ספירת מתלי תאים ספירת מתלי תאים באמצעות הליך 6 x 6 צלחת טיפה20. עיין בקובץ משלים 1 לקבלת תמונות המתארות את שיטת לוח השחרור בגודל 6 x 6. לייבש באוויר צלחות אגר Brucella עם מכסה כבוי במכסה מנוע זרימה למינרית במשך 45 דקות. הוסף 200 μL של תרחיף חיידקי לשש שורות (A-F) בטור הראשון של צלחת 96 בארות. מפזרים 180 μL של תווך Brucella על פני שש שורות של העמודות הנותרות (2-12). הכינו דילולים טוריים פי עשרה באמצעות העברות של 20 μL.לדוגמה, העבר 20 μL של דגימה מעמודה אחת לעמודה שתיים. חזור על תהליך זה עבור 6 עמודות לפחות. ריפלוקס מערבבים כל תרחיף עשר פעמים באמצעות הפיפטה, ומשנים את הקצוות בין כל העברה. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להפקיד 7 טיפות μL משש שורות של עמוד על פני השטח של צלחת אגר Brucella. חזור על הפעולה כדי ליצור מערך של 6 x 6, כדי לוודא שהשורות משוכפלות טכנית בין עמודות. יבשו את הצלחות באוויר למשך 5 דקות, ולאחר מכן הפכו את הצלחת. דגירה על צלחות ב 42 ° C במשך 24 שעות. ספרו את מספר המושבות בכל דילול מייצג.

Representative Results

השפעת לחות בצלחות אגר ברוסלה לסינון פסיבי של קמפילובקטרלקמפילובקטר גנום קטן והוא חסר מספר גנים לתגובת עקה הנפוצים בחיידקים אחרים, כגון E. coli O157:H7 וסלמונלה. לכן, הוא רגיש יותר לעקות סביבתיות שונות ואינו יכול לסבול התייבשות או רמות חמצן בסביבה. לעומת זאת, מדיום אגר לח מדי יכול להציף את המסנן. זה לא רק גורם לדיפוזיה של הדגימה מחוץ למסנן, אלא גם מגדיל את זמן החשיפה לחמצן21. כדי לקבוע את התנאים המתאימים לבידוד מבוסס מסנן של קמפילובקטר, לוחות אגר Brucella יובשו עם מכסים הוסרו במשך 0 שעות, 1 שעות, 2 שעות, ו 3 שעות בתוך ארון בטיחות ביולוגי והוערכו עבור היעילות של תאי קמפילובקטר לחצות מסנן בגודל 0.65 מיקרומטר בגודל נקבוביות. ארבע אליציטוטים של 20 μL של תרביות C. jejuni S27 בריכוזים של 1.53 x 104 ו- 1.53 x 105 CFU/mL הודבקו על כל קרום מסנן שהונח על גבי צלחת ברוסלה. לאחר 15 דקות של חדירה, הוסרו הפילטרים, וצלחות הודגרו בן לילה לצמיחת תאים. תאים מ-5 לוחות משוכפלים נספרו וסומנו בטבלה 1. התוצאות הצביעו על כך שצלחות האגר שיובשו במשך שעתיים ושלוש שעות תפקדו באופן דומה עם מספר כמעט שווה של תאים שהתאוששו מסינון פסיבי. באופן ניכר, הלוחות שיובשו בתנאים אלה במשך 0 שעות ושעה אחת לא אפשרו לתאים לחצות את הממברנה במלואה בתוך פרק הזמן של 15 דקות בשימוש. השוואה בין קרומי מסנן שונים בגודל נקבוביות לבידוד קמפילובקטר מכבדי עוףבהתחשב בגדלי תאי הקמפילובקטר (0.5-5 מיקרומטר אורך ו-0.2-0.9 מיקרומטר רוחב) ומגוון רחב של גדלי חלקיקי מזון, מסנני תאית אצטט עם גדלים של 0.45 מיקרומטר ו-0.65 מיקרומטר נקבוביות נבדקו ליעילות מעבר הקמפילובקטר כאשר ניתן להם זמן דגירה של 15 דקות. דגימות מזון המכילות 450 גרם של כבד עוף מתובל עם 153 CFU של C. jejuni ולאחר מכן מועשר במשך הלילה שימשו לניסוי. כבקרה ללא סינון, ציפוי ישיר של דגימת ההעשרה נכלל במקביל. התוצאות (איור 2) מ-5 לוחות משוכפלים הראו באופן עקבי שהמסנן בגודל נקבוביות של 0.65 מיקרומטר איפשר ליותר תאים לעבור מאשר מסננים בגודל נקבוביות של 0.45 מיקרומטר, וכתוצאה מכך התקבלו יותר תאים ~פי 29. מסנן גודל הנקבוביות של 0.45 מיקרומטר שמר על יותר מדי תאים בצד העליון של המסנן, וכתוצאה מכך התאוששות נמוכה משמעותית של קמפילובקטר ממזון בהשוואה למסנן בגודל נקבוביות של 0.65 מיקרומטר. כצפוי, הייתה מדשאה של אורגניזמים שונים שגדלו על לוחות הבקרה ללא פילטר. יישום סינון פסיבי בבידוד קמפילובקטר מעוף קמעונאיבגלל התנועתיות יוצאת הדופן של תאי קמפילובקטר , נבחרה טכניקת הסינון הפסיבי לבידוד של C. jejuni ו – C. coli ממוצרי בשר קמעונאיים, אשר בדרך כלל מזוהמים באורגניזמים רבים ברקע. בין השנים 2014-2023 נאספו בסך הכל 79 אריזות בשר נא, הכוללות חלקים שונים של בשר עוף, כבדי עוף, כבדי בקר וכבדי עגל, מסופרמרקטים מקומיים שונים. מכל אריזה, 450 גרם נדגמו לבידוד של קמפילובקטר spp. על ידי שילוב של העשרה סלקטיבית של קמפילובקטר במרק בולטון המכיל דם וסינון פסיבי של התאים דרך מסנן תאית אצטט בגודל 0.65 מיקרומטר בגודל נקבוביות ישירות על צלחת אגר של Brucella, 49 זני קמפילובקטר בודדו בהצלחה מ-79 דגימות בשר (טבלה 2). איור 3 מייצג את התוצאה של בידוד זן קמפילובקטר חדש מכבד עוף. השיטה הוכחה שוב ושוב כרגישה, ספציפית וחסכונית. זיהוי והבחנה של C. jejuni ו – C. coli מבודדיםכדי לאמת את הסוג ולהבדיל בין המינים של קמפילובקטר מבודד המתקבל מבשר נא, נעשה שימוש בבדיקת qPCR מרובת משתתפים המגבירה את מטרות הגן הספציפיות (hipO ו-cdtA) עבור C. jejuni ו-C. coli, ובקרת הגברה פנימית (IAC). ה-IAC נכלל כאינדיקטור שלילי-כוזב בהגברה מקבילה של גנים מרובים. הבדיקה יושמה בפורמט של 96 בארות עם ליזה מהירה של תאים ומיצוי DNA באמצעות מגיב זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים). טבלה 2 מסכמת את תוצאות זיהוי המינים של הזנים C. jejuni ו-C. coli. כאימות נוסף, תוצאות ריצוף גנום שלם אישרו את המינים של כל המבודדים (הנתונים לא מוצגים). איור 1: דיאגרמת זרימת עבודה לבידוד וזיהוי של מיני קמפילובקטר מבשר קמעונאי. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: השפעת גודל המסנן על התאוששות הקמפילובקטר. התוצאות מצביעות על כך שמסנן 0.65 מיקרומטר יכול לשחזר בממוצע 900 ± 138 מושבות, בעוד מסנן 0.45 מיקרומטר משחזר 31 ± 7 מושבות. התוצאות נוצרו מ N = 20 (5 לוחות עם 4 טיפות / צלחת) ומבחן t של תלמיד מציין שהאמצעים שונים סטטיסטית (p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: בידוד של קמפילובקטר על-ידי סינון פסיבי של דגימות עוף מועשרות. (A) מתאר את ארבע טיפות 20 μL של דגימה מועשרת שהושקעו על מסנן קרום הניטרוצלולוז. התמונה נאספה במהלך 15 דקות של סינון פסיבי. (B) מתאר את הצלחת לאחר הסרת מסנן הניטרוצלולוז. ארבעת הכתמים מציינים היכן הדגימה המועשרת חצתה את הממברנה. (C) מתאר את הצלחת לאחר דגירה של 24 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. טבלה 1: השפעת זמן הייבוש של לוחות אגר ברוסלה על סינון פסיבי של C. jejuni. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 2: הזנים C. jejuni ו-C. coli מבודדים מבשר נא. במהלך פרק הזמן שבין 2008 ל-2023, בודדו 36 זני C. jejuni ו-13 C . coli מ-79 אריזות בשר ב-24 מוצרים קמעונאיים ייחודיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. קובץ משלים 1: תמונות לאורך תהליכי הבידוד והספירה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

משמעות הפרוטוקול
C. jejuni ו– C. coli היו שני המינים העיקריים של קמפילובקטר שנמצאו נפוצים בעופות²² ובכבדי בעלי חיים^23,24. במחקר זה, דגימות בשר של חלקי עוף (רגליים, כנפיים וירכיים), כבדי עוף וכבדי בקר נאספו באופן אקראי במהלך תקופות זמן שונות, ומחנויות קמעונאיות ויצרנים שונים לצורך בידוד של קמפילובקטר spp. מתוך 49 זני הקמפילובקטר שבודדו, 36 זוהו כ-C. jejuni ו-13 כ-C. coli, ולא נמצאו זנים אחרים של קמפילובקטר, דבר העולה בקנה אחד עם דיווחים אחרים^{על 25}.

הבדיקה מבוססת על מורפולוגיית התא בצורת ספירלה ותנועתיות אופיינית דמוית חולץ פקקים של קמפילובקטר spp. טכניקת סינון פסיבית פשוטה אך יעילה^26,27 שניצלה את המורפולוגיה של התא בצורת ספירלה (ארוך, דק, 0.2-0.9 על 0.5-5 מיקרומטר) ואת תנועתיות חולץ הפקקים החזקה, שימשה להפרדת קמפילובקטר מתערובת של אורגניזמים ברקע. התנועתיות הגבוהה של הקמפילובקטר אפשרה לתאים לחצות את מסנני הממברנה ולנוע לעבר תנאים נוחים הנמצאים בתווך האגר, בעוד מיקרואורגניזמים אחרים ברקע ממוצרי הבשר לא הצליחו לעבור דרכם. שיטה זו זולה, מהירה וסלקטיבית יחסית, מה שהופך אותה למתאימה לשימוש במגוון מסגרות, כולל מתקני עיבוד מזון, מעבדות קליניות ומעבדות מחקר.

מאמר חלוצי שצוטט לעתים קרובות קובע כי מסנן 0.45 מיקרומטר עבד כל כך טוב כי 0.65 מיקרומטר לא הוערך²⁸. תוצאות המחקר הנוכחי מצביעות על כך שהמסנן בגודל נקבוביות של 0.65 מיקרומטר הפגין ביצועים טובים משמעותית מגודל הנקבוביות של 0.45 מיקרומטר, וכתוצאה מכך גדל פי 29 במספר התאים שהתאוששו מההעשרה. הדבר חשוב מכיוון שהמסננים שנבחרו אינם מציגים סלקטיביות מופחתת כפי שדווח קודם לכן²⁹. יתר על כן, כפי שידוע כי סינון יפחית באופן משמעותי את כמות הקמפילובקטר שהוחזר בהשוואה לציפוי ישיר³⁰, לכן, הגדלת גודל הנקבוביות משפרת את התאוששות המיקרואורגניזם, אשר עולה בקנה אחד עם ממצאים שדווחו בעבר²¹. זה משמעותי מכיוון שכל התאים שחצו את המסננים יצרו מושבות קמפילובקטר אחידות, מה שמצביע על כך ששני המסננים הספיקו כדי למנוע מעבר של מיקרופלורה וחלקיקי מזון אחרים. בנוסף, תרשים הזרימה^{FSIS 7} מציין את הפוטנציאל לייצור תוצאות מורחב עקב פסים מחדש מבודדים על לוחות Campy-Cefex המכילים אנטיביוטיקה. לעומת זאת, הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה, המשלב שימוש בסינון והעשרה סלקטיבית עם cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim ו-vancomycin, לא הצריך פסים מחדש.

השיטה הנוכחית המיושמת עולה בקנה אחד עם תוכניות הדגימה והאימות הנוכחיות של FSIS¹⁷. מכיוון שרמת זיהום הקמפילובקטר יכולה להיות נמוכה (153 CFU/450 גרם עוף), השטיפה עוברת צנטריפוגה כדי לרכז את הדגימה פי ארבעה, מה שמגביר את רגישות הבדיקה. לאחר ריכוז השטיפה פי 4, הדגימות מועשרות במשך 48 שעות ומוקרנות במערכת זיהוי מולקולרית (MDS) כדי לשכפל את השיטה הנהוגה על ידי מעבדות FSIS (הנתונים אינם מוצגים). יש לציין כי השיטה המתוארת טרם נכשלה בזיהוי זנים חיוביים תוך 24 שעות שזוהו על ידי מערכת הזיהוי המולקולרית באמצעות 48 שעות העשרה (הנתונים אינם מוצגים). לבסוף, יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא שהוא יכול לספק מידע הקשור למיני החיידקים ולזהות אם הקמפילובקטר הוא C.coli, C. jejuni או C. lari, בעוד MDS שאומץ ב- MLG 41.07 יכול לספק רק תגובה חיובית / שלילית בינארית עבור קמפילובקטר.

שלבים קריטיים
פרוטוקול הבידוד והזיהוי של קמפילובקטר מחייב דיוק במהלך צנטריפוגה, סינון ואנליזה מולקולרית. דילולים מדויקים, תנאי דגירה נאותים והקפדה על תנאי בדיקת qPCR חיוניים לזיהוי מינים אמין.

כחיידק מיקרואירופילי, קמפילובקטר הוא שביר מאוד ורגיש לעקות סביבתיות שונות וזקוק לתנאי גדילה ייחודיים 31,32,33^. בדגימות מזון שעוברות בדרך כלל תקופות ארוכות של הובלה ואחסון, תאי קמפילובקטר רבים נמצאים אולי במצב רדום או במצב פצוע תת-קטלני/קטלני^34,35. לכן, חשוב לשחזר את התאים הלחוצים ממטריצות המזון שלהם ולגדל אותם לריכוז גבוה יותר. בשלב הראשון של ההליך, השתמשנו במרק בולטון בתוספת דם סוס ואנטיביוטיקה להעשרה סלקטיבית של קמפילובקטר מהמזון. תוספת הדם שימשה כחומר מרווה חמצן כדי להתגבר על ההשפעות השליליות של רדיקלים חמצן חופשי³⁶. האנטיביוטיקות שימשו לעיכוב צמיחת מיקרופלורת רקע³⁷.

כדי למזער את זמן החשיפה של קמפילובקטר לחמצן אטמוספרי בסביבה, נבחרה תקופת דגירה של 15 דקות כדי לאפשר לתאים לחצות את המסנן. כמו כן, הלחות של צלחת אגר Brucella מתחת לפילטר שיחק תפקיד חשוב בקצב המעבר. באופן ספציפי, התוצאות מבדיקת צלחות אגר מיובשות במשך 0 שעות, 1 שעות, 2 שעות ו -3 שעות הצביעו על כך שתכולת לחות גבוהה במסנן מנעה מתאים לעבור. קריטי לא פחות הוא המיקום המדויק של מסננים וטיפות על הצלחות והמסננים, שניהם משפיעים על הצלחת בידוד התאים.

מלכודות ומגבלות פוטנציאליות
תוך הצגת גישה מובנית לבידוד וזיהוי זני קמפילובקטר מדגימות עוף גולמי, מספר מגבלות של פרוטוקול זה ראויות לתשומת לב. זיהום חיצוני, לוחות מיובשים מספיק, סתימת מסננים המעכבת תנועה מיקרוביאלית, לכידה של מיקרואורגניזמים בתוך הכדורית, איטום חלקי של תא האטמוספירה וטיפות המתפשטות מעבר לגבולות המסנן הם בין המלכודות העיקריות.

הפרדה לא מספקת של המיקרואורגניזמים ממשטחי המזון או כליאתם בתוך חלק הארי של הדגימה עלולה לעכב את בידודם בשיטה זו. בנוסף, הסתמכות על תנועתיות מיקרוביאלית לצורך מעבר דרך מסננים פסיביים מהווה מגבלה בולטת; ייתכן שקרומי המסנן שמרו על כמה זני קמפילובקטר פחות תנועתיים, שכן הוכח כי מסננים יכולים להפחית את יעילות הלכידה של פתוגנים מיקרוביאליים במזון³⁸. מגבלות נוספות כוללות את אופי האצווה של תהליכי צנטריפוגה וסינון, רגישות לסתימת סינונים וחוסר יעילות בפיזור הכדוריות שנוצרו, מה שישפיע על דיוק העומסים המיקרוביאליים. מגבלות אלה מדגישות באופן קולקטיבי את הצורך בזהירות ובמתודולוגיות משלימות כדי להבטיח ניתוח מקיף, במיוחד כאשר מתמודדים עם סוגי מדגם מגוונים או מחפשים יכולות תפוקה גבוהה.

הצעות לפתרון בעיות
כדי למנוע בעיות פוטנציאליות, תחילה ודא שכל החומרים עומדים בתקני האיכות הדרושים ולא פג תוקפם. פתור בעיות של מסננים סתומים על-ידי שימוש פוטנציאלי בסינון נוסף כדי להסיר זיהומים גדולים שעלולים להגביל את המעבר של הקמפילובקטר דרך קרום הניטרוצלולוז. אם נצפה זיהום, יש לוודא שהטיפות לא הונחו קרוב מדי לקצה הפילטר ואפשרו לנוזלים להגיע לאגר על ידי סיבוב המסנן ולא דרך הנקבוביות. אם אין צמיחה מספקת לאחר ההעשרה, יש לוודא שהאטמים של המיכלים האטמוספריים הדוקים ואינם דולפים.

עידון והרחבה פוטנציאליים
חקר חומרי סינון חלופיים עשוי לשפר את המעבר המיקרוביאלי ולאפשר להרחיב פרוטוקול זה לשימוש בבידוד מיקרואורגניזמים תנועתיים אחרים מתערובות הטרוגניות כגון מזון. מומלץ לזהות בקרות כדי לשמור על גרסאות קמפילובקטר פחות תנועתיות מבלי להשפיע לרעה על הספציפיות. בנוסף, בעוד שבדיקת qPCR מרובת משתתפים ששימשה במחקר זה הוכחה כבעלת יכולות לזהות C.lari,^{ניתן לכלול בניסוי זה 18} מיני קמפילובקטר מעניינים אחרים.

לסיכום, באמצעות הערכת פרמטרים והגדרות שונות, נקבעו התנאים המתאימים לבידוד מבוסס מסנן וזיהוי ברמת המין של C. jejuni ו- C. coli מהמזון. השיטה הוכחה כרגישה, ספציפית, חזקה וחסכונית. על ידי החלתו על דגימות מזון אמיתיות, הפרוטוקול הצליח לבודד 36 זני C. jejuni ו-13 C. coli מ-79 אריזות בשר.

הפרוטוקול תואם את הנחיית FSIS 10,250.1¹⁷, המתווה את הנוהל לדגימת חלקי עוף גולמי, ואת MLG 41.07⁶ לבידוד וזיהוי של קמפילובקטר. הנתונים מצביעים על כך שריכוז הדגימה פי 4 והעשרתה במשך 24 שעות, יחד עם סינון וציפוי, מניב מושבות מבודדות ומאושרות תוך 48 שעות לעומת 96 שעות. הפרוטוקול תואם לשיטות מבוססות DNA כגון ריצוף גנום כדי לספק אפיון מקיף של זני קמפילובקטר , כולל פרופילי העמידות האנטי-מיקרוביאלית שלהם, תחזיות אלימות ויחסים פילוגנטיים. הפרוטוקול מייצג חלופה מבטיחה להתאוששות יעילה ובידוד של קמפילובקטר spp. מעופות גולמיים, אשר יכול להקל על מחקרים אפידמיולוגיים והתערבויות בבריאות הציבור.

Materials

Agar – Solidifying Agent (Difco)	Becton, Dickinson and Company (BD)	281230
Analytical Balance	Mettler Toledo	JL602-G/L	Equipment
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S	Equipment
Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin	Oxoid Ltd.	SR0183E
Atmosphere Control Gas Pak  (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2)	Becton, Dickinson and Company (BD)	260680
Atmosphere Control Vessel,  GasPak EZ CampyPak container system	Becton, Dickinson and Company (BD)	260678
Autoclave – Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer	Steris plc	LV-250	Equipment
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+	Labconco Corporation	302411101	Equipment
Bolton broth	Oxoid Ltd.	CM0983
Brucella broth (Difco)	Becton, Dickinson and Company (BD)	211088
Buffered Peptone Water	Bio-Rad Laboratories Inc.	3564684
Centrifuge Microcentrifuge 5424	Eppendorf	5424	Equipment
Centrifuge, Avanti J-25	Beckman Coulter, Inc.		Equipment
Chicken thighs, wings, drumsticks, livers	Local retailers
DNA Extraction – PreMan Ultra Sample Preparation Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	4318930
FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3')	Integrated DNA Technologies
Filter – 0.45 µm sterile cellulose acetate filter	Merck-Millipore LTD	DAWP04700
Filter – 0.65 µm sterile cellulose acetate filter	Merck-Millipore LTD	HAWG04700
forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ')	Integrated DNA Technologies
forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3')	Integrated DNA Technologies
forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3')	Integrated DNA Technologies
HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3')	Integrated DNA Technologies
Incubator – Inova 4230 refrigerated incubator shaker	New Brunswick Scientific	4230	Equipment
Inoculating Loop – Combi Loop  10µL and 1µL	Fisher Scientific International, Inc	22-363-602
Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3')	Integrated DNA Technologies
Laked horse blood	Remel Inc.	R54072
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Mettler Toledo	17014382	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+	Mettler Toledo	17014384	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+	Mettler Toledo	17014388	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Mettler Toledo	17014391	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Mettler Toledo	17014392	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Mettler Toledo	17013805	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+	Mettler Toledo	17013803	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass  Bottle, with GL45 Screw Cap	Corning Inc.	1396-1L	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap	Corning Inc.	1397-2L	Equipment
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs	MilliporeSigma	Z707902
Mixer – Vortex Genie 2	Scientific Industries Inc.	SI-0236	Equipment
Motorized pipette controller, PIPETBOY2	INTEGRA Biosciences Corp.		Equipment
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression	Thermo Fisher Scientific Inc.	4369542
Petri Dish Rotator -  bioWORLD Inoculation Turntable	Fisher Scientific International, Inc	3489E20	Equipment
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm)	Fisher Scientific International, Inc	FB0875713
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8	Mettler Toledo	30389273
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10	Mettler Toledo	30389270
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10	Mettler Toledo	30389276
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors	Thermo Fisher Scientific Inc.	8093-11
Realtime PCR – 7500 Real-Time PCR system	(Applied Biosystems, Foster City, CA)		Equipment
reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3')	Integrated DNA Technologies
reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3')	Integrated DNA Technologies
reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3')	Integrated DNA Technologies
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170356N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170372N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170357N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170376N
Spreader – Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders	Fisher Scientific International, Inc	14-665-230
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags	Thermo Fisher Scientific Inc.	01-812
TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3')	Integrated DNA Technologies
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700)	Applied Biosystems		Equipment
Water Filtration – Elga Veolia Purelab Flex	Elga LabWater	PF2XXXXM1-US	Equipment