استراتيجية البنوك الحيوية لعضويات سرطان المبيض: معالجة عدم التجانس بين المرضى عبر الأنواع الفرعية النسيجية ومراحل المرض
Summary
يقدم هذا البروتوكول إطارا منهجيا لإنشاء عضويات سرطان المبيض من مراحل المرض المختلفة ويعالج تحديات التباين الخاص بالمريض لزيادة الغلة وتمكين التوسع القوي على المدى الطويل للتطبيقات اللاحقة. يتضمن خطوات مفصلة لمعالجة الأنسجة ، والبذر ، وضبط متطلبات الوسائط ، وتلطيخ التألق المناعي.
Abstract
في حين أن إنشاء بنك حيوي لسرطان المبيض من المواد العضوية المشتقة من المريض جنبا إلى جنب مع معلومات الخلفية السريرية الخاصة بهم يعد بالتقدم في البحث ورعاية المرضى ، إلا أن التوحيد القياسي لا يزال يمثل تحديا بسبب عدم تجانس هذا الورم الخبيث القاتل ، جنبا إلى جنب مع التعقيد المتأصل في التكنولوجيا العضوية. يوفر هذا البروتوكول القابل للتكيف إطارا منهجيا لتحقيق الإمكانات الكاملة لعضويات سرطان المبيض مع الأخذ في الاعتبار التباين الخاص بالمريض للأسلاف. من خلال تنفيذ سير عمل تجريبي منظم لتحديد ظروف الاستزراع المثلى وطرق البذر ، مع الاختبار المتوازي للبذر ثلاثي الأبعاد المباشر مقابل مسار 2D / 3D ، نحصل ، في معظم الحالات ، على خطوط توسيع قوية طويلة الأجل مناسبة لمجموعة واسعة من تطبيقات المصب.
والجدير بالذكر أن البروتوكول قد تم اختباره وإثبات كفاءته في عدد كبير من الحالات (N = 120) من المواد الأولية غير المتجانسة للغاية ، بما في ذلك سرطان المبيض عالي الدرجة ومنخفض الدرجة ومراحل المرض مع إزالة الانتفاخ الأولية ، والمرض المتكرر ، والعينات الجراحية بعد النيو المساعدة. ضمن بيئة إشارات خارجية منخفضة Wnt و BMP عالية ، لاحظنا أن الأسلاف معرضون بشكل مختلف لتنشيط مسار Heregulin 1 ß (HERß-1) ، مع تعزيز HERß-1 لتشكيل الأعضاء في البعض بينما تثبيطه في البعض الآخر. بالنسبة لمجموعة فرعية من عينات المريض ، يستلزم التكوين العضوي الأمثل والنمو طويل الأجل إضافة عامل نمو الخلايا الليفية 10 و R-Spondin 1 إلى الوسط.
علاوة على ذلك ، نسلط الضوء على الخطوات الحاسمة لهضم الأنسجة وعزل السلف ونشير إلى أمثلة حيث تكون الزراعة القصيرة في 2D على البلاستيك مفيدة لتشكيل عضوي لاحق في مصفوفة مستخلص الغشاء القاعدي من النوع 2. وبشكل عام، يتطلب البنك الحيوي الأمثل اختبارا منهجيا لجميع الظروف الرئيسية بالتوازي لتحديد بيئة نمو مناسبة للخطوط الفردية. يصف البروتوكول أيضا إجراء المناولة للتضمين والتقسيم والتلوين بكفاءة للحصول على صور عالية الدقة للمواد العضوية ، وهو أمر مطلوب للتنميط الظاهري الشامل.
Introduction
لا تزال الإدارة السريرية لمرضى سرطان المبيض الظهاري صعبة بسبب عرضه السريري غير المتجانس في المراحل المتقدمة ومعدلات التكرار العالية1. يتطلب تحسين فهمنا لتطور سرطان المبيض والسلوك البيولوجي مناهج بحثية تعالج التباين الخاص بالمريض أثناء مسار المرض ، والاستجابة للعلاج ، والسمات النسيجية المرضية وكذلك الجزيئية2.
إن البنوك الحيوية، التي تتميز بالجمع المنهجي والحفظ طويل الأجل لعينات الورم المشتقة من مرضى سرطان المبيض جنبا إلى جنب مع معلوماتهم السريرية، توفر الحفاظ على مجموعة كبيرة من المرضى في مراحل المرض المختلفة، بما في ذلك عينات الورم من جراحات إزالة الانتفاخ الأولية، وبعد العلاج الكيميائي المساعد الجديد ومن الأمراض المتكررة. إنه يحمل إمكانات قيمة للنهوض بأبحاث السرطان بمثابة مورد للمؤشرات الحيوية الواعدة والأهداف العلاجية3. ومع ذلك ، فإن طرق البنوك الحيوية التقليدية ، مثل تثبيت الفورمالين والتجميد ، ليست قابلة لإجراء دراسات وظيفية على عينات الورم الأصلية بسبب فقدان الصلاحية وتعطيل بنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد الأصلية 4,5.
تعتمد دراسات الآليات الجزيئية ، في علم الأورام وما بعده ، بشكل حاسم على استخدام النماذج التجريبية المناسبة التي تعكس بأمانة بيولوجيا المرض وتحافظ على الخصائص المختبرية للأنسجة التي لوحظت في الجسم الحي. تقوم الكائنات العضوية المشتقة من المريض ، بناء على الحفاظ على إمكانات التجديد ، بإعادة إنتاج الهيكل الأصلي للظهارة ووظيفتها في المختبر وتسمح بالاختبار في سياق خاص بالمريض. لذلك ، فقد برزت كأدوات واعدة للغاية لأبحاث السرطان والطب الشخصي ، وسد الفجوة بين التنوع السريري والبحوث المختبرية6،7،8،9. يمكن تطبيق الاستراتيجيات العلاجية المصممة خصيصا بناء على الاستجابات الدوائية الفردية للخطوط العضوية واختبار الأهمية الوظيفية للملامح الجزيئية مباشرة على رعاية المرضى10,11. إن إمكانية الزراعة طويلة الأجل بما في ذلك الخصائص الخاصة بالمريض وجمع البيانات السريرية المستقبلية ذات الصلة بمرور الوقت تبشر بخير كبير لتحديد العوامل النذير والتنبؤية الجديدة التي ينطوي عليها تطور المرض وآليات المقاومة 3,9.
ومع ذلك ، فإن بناء بنك حيوي يتضمن عضويات من عينات أورام مختلفة يتطلب مزيجا من الالتزام الصارم بالمنهجية المعقدة ووضع بروتوكولات لسهولة الصيانة12. يضمن توحيد العمليات إمكانية إنشاء البنك الحيوي وصيانته بكفاءة من قبل موظفين مدربين حتى في حالة الدوران المرتفع ، مع الالتزام في نفس الوقت بأعلى معايير الجودة13. أفادت العديد من الدراسات عن الجيل الناجح من الخطوط العضوية المستقرة لسرطان المبيض المقابلة للملف الطفري والظاهري للورم الأصلي بمعدلات كفاءة متفاوتة. ومع ذلك ، لا تزال البنوك الحيوية الروتينية تمثل تحديا في الممارسة العملية ، لا سيما بالنسبة للنمو المستقر طويل الأجل للخطوط ، وهو شرط أساسي للتوسع على نطاق واسع أو التحرير الجينومي الناجح.
على وجه الخصوص ، لا تزال مسألة قابلية التوسع معرفة غامضة في هذا المجال حيث يتم أحيانا احتساب المواد العضوية التي تظهر إمكانات نمو بطيئة ومحدودة كخطوط ثابتة. كما أوضح في البداية هوفمان وآخرون ، وهي دراسة وفرت نتائجها الرئيسية الأساس لهذا البروتوكول الأكثر تطورا ، فإن المعالجة المثلى لأنسجة سرطان المبيض تتطلب استراتيجية فريدة لاستيعاب عدم التجانس14. تم تأكيد التوصيف الظاهري للعضويات التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة والتشابه الوثيق مع أنسجة الورم الأبوي من خلال تسلسل الحمض النووي للوحة وتحليل النسخ للثقافات الناضجة (4-10 أشهر من الزراعة) مما يدل على استقرار النموذج8،9،12،14.
على النقيض من بيئة paracrine التي تنظم التوازن في قناة فالوب الصحية ، فإن الطبقة الظهارية ، التي من المحتمل أن تنتج سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC) ، وإمكانية تجديد السرطان ، وقدرة تكوين الأعضاء ، أقل اعتمادا على مكملات Wnt الخارجية. علاوة على ذلك ، أثبتت إشارات البروتين المورفولوجي النشط للعظام (BMP) ، والتي تتميز بغياب Noggin في الوسط العضوي ، أنها مفيدة لإنشاء ثقافات طويلة الأجل من رواسب الأنسجة الصلبة لسرطان المبيض14,15. خلال البنوك الحيوية المنهجية للرواسب الصلبة لسرطان المبيض ، أكدنا هذه النتائج وأنشأنا خط الأنابيب ، مع التفاصيل الموضحة في هذا البروتوكول الذي يضمن التوسع المستدام على المدى الطويل في معظم الحالات. نجد أن الاختبار المتوازي لتركيبات الوسائط المختلفة وطرائق البذر عند العمل مع العزلات الأولية ضروري لتحسين إنشاء خطوط عضوية مستقرة طويلة الأجل وزيادة الغلة مما يتيح انتشارا قويا وتوسعا إلى تنسيقات الآبار المتعددة المطلوبة للتجارب النهائية16.
علاوة على ذلك ، فإن نقاء وجودة العينات التي تم جمعها أثناء الجراحة لهما أهمية حاسمة للإمكانات الانتقالية لعضويات سرطان المبيض في الأبحاث الأساسية والتشخيص الجزيئي. يتطلب تعقيد العرض السريري ل HGSOC تعاونا وثيقا بين الجراحين وأطباء الأورام والعلماء في المختبر لضمان تحديد المواد ذات الصلة بشكل صحيح ، والحفاظ على ظروف النقل ثابتة ، ويتم إنشاء خطوط عضوية بكفاءة عالية تمثل أهم خصائص مرض كل مريض. يوفر هذا البروتوكول إطارا موحدا ولكنه قابل للتكيف لالتقاط الإمكانات الكاملة لعضويات سرطان المبيض ، مع الأخذ في الاعتبار عدم التجانس الذي يميز سرطان المبيض16,17. والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول يتيح البنوك الحيوية الموثوقة لمجموعة واسعة من العرض السريري لسرطان المبيض ، بما في ذلك الأنواع النسيجية المختلفة (سرطان المبيض عالي الدرجة ومنخفض الدرجة ، LGSOC) ، ورواسب مختلفة من نفس المرضى الذين يظهرون اختلافات في تنظيم الجذعية ، والأنسجة من العمليات الجراحية في إعداد ما بعد المساعد الجديد ، ومواد الخزعة ، وعينات من العمليات الجراحية في المرحلة المتكررة من تطور المرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعالج البروتوكول المصمم التحديات السابقة للبنوك الحيوية العضوية لسرطان المبيض فيما يتعلق بتكوين الأعضاء وإمكانية المرور على المدى الطويل ويضمن توليد خطوط قابلة للتوسيع بالكامل من غالبية رواسب الورم الصلبة. تؤثر عملية الجمع الجراحي لعينات الورم لاستخدامها في توليد المواد العضوية بشكل ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل الدراسة من قبل مركز أبحاث السرطان الألماني DKTK ، موقع شريك ميونيخ ، شراكة بين DKFZ ومستشفى جامعة LMU ميونيخ. يتم دعم الدراسة أيضا من خلال منحة مساعدة السرطان الألمانية (#70113426 و #70113433). تم إجراء تضمين البارافين للأنسجة والمواد العضوية في المنشأة الأساسية لمعهد التشريح ، كلية الطب ، LMU ميونيخ ، ميونيخ. تم إجراء التصوير البؤري في مرفق التصوير الحيوي الأساسي في المركز الطبي الحيوي (BMC). يريد المؤلفون أن يشكروا سيمون هوفمان وماريا فيشر وكورنيليا هيربست وسابين فينك ومارتينا رحمة على المساعدة التقنية.
Materials
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).
- Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
- Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).
- Coppola, L., et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med. 17 (1), 172 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
- Larsen, B. M., et al. A pan-cancer organoid platform for precision medicine. Cell Rep. 36 (4), 109429 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).
- Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 3 (2), 101407 (2022).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nat Mater. 21 (2), 143-159 (2022).
- Hoffmann, K., et al. Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment. EMBO J. 39 (6), e104013 (2020).
- Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
- Trillsch, F., et al. Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential. STAR Protoc. 4 (3), 102484 (2023).
- Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
- Fuerer, C., Nusse, R. Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway. PLoS One. 5 (2), e9370 (2010).
- . Leica ASP300S – Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1 Available from: https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf (2021)
- Thermo Scientific. . Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual. , (2009).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 10 (1), 12581 (2020).
