Strategi for biobanking af ovariecancerorganoider: adressering af interpatient heterogenitet på tværs af histologiske undertyper og sygdomsstadier

Summary

Denne protokol tilbyder en systematisk ramme for etablering af ovariecancerorganoider fra forskellige sygdomsstadier og adresserer udfordringerne ved patientspecifik variabilitet for at øge udbyttet og muliggøre robust langsigtet ekspansion til efterfølgende applikationer. Det inkluderer detaljerede trin til vævsbehandling, såning, justering af mediekrav og immunofluorescensfarvning.

Abstract

Mens etableringen af en biobank for kræft i æggestokkene fra patientafledte organoider sammen med deres kliniske baggrundsinformation lover fremskridt inden for forskning og patientpleje, er standardisering fortsat en udfordring på grund af heterogeniteten af denne dødelige malignitet kombineret med den iboende kompleksitet af organoidteknologi. Denne tilpasningsdygtige protokol giver en systematisk ramme for at realisere det fulde potentiale af ovariecancerorganoider i betragtning af en patientspecifik variabilitet af forfædre. Ved at implementere en struktureret eksperimentel arbejdsgang for at vælge optimale dyrkningsforhold og såningsmetoder med parallel test af direkte 3D-såning versus en 2D / 3D-rute opnår vi i de fleste tilfælde robuste langsigtede ekspansionslinjer, der er egnede til en bred vifte af downstream-applikationer.

Især er protokollen blevet testet og vist sig effektiv i et stort antal tilfælde (N = 120) af meget heterogent udgangsmateriale, herunder højkvalitets og lavgradig ovariecancer og stadier af sygdommen med primær debulking, tilbagevendende sygdom og post-neoadjuverende kirurgiske prøver. Inden for et eksogent signalmiljø med lav Wnt, høj BMP observerede vi, at forfædre var forskelligt modtagelige for aktiveringen af Heregulin 1 ß (HERß-1)-vejen, hvor HERß-1 fremmer organoiddannelse hos nogle, mens den hæmmer den i andre. For en delmængde af patientens prøver nødvendiggør optimal organoiddannelse og langvarig vækst tilsætning af fibroblastvækstfaktor 10 og R-Spondin 1 til mediet.

Desuden fremhæver vi de kritiske trin i vævsfordøjelse og stamcelleisolering og peger på eksempler, hvor kort dyrkning i 2D på plast er gavnlig for efterfølgende organoiddannelse i kældermembranekstrakt type 2-matrixen. Samlet set kræver optimal biobanking systematisk test af alle hovedforhold parallelt for at identificere et passende vækstmiljø for individuelle linjer. Protokollen beskriver også håndteringsproceduren for effektiv indlejring, sektionering og farvning for at opnå billeder i høj opløsning af organoider, hvilket er nødvendigt for omfattende fænotypning.

Introduction

Klinisk behandling af patienter med kræft i æggestokkene er fortsat udfordrende på grund af dets heterogene kliniske præsentation på fremskredne stadier og høje tilbagefaldsrater¹. Forbedring af vores forståelse af udvikling af kræft i æggestokkene og biologisk adfærd kræver forskningsmetoder, der adresserer den patientspecifikke variabilitet i løbet af sygdommen, behandlingsrespons og histopatologiske såvel som molekylære træk².

Biobanking, der er kendetegnet ved systematisk indsamling og langsigtet bevarelse af tumorprøver afledt af ovariecancerpatienter sammen med deres kliniske oplysninger, giver bevarelse af en stor patientkohorte i forskellige sygdomsstadier, herunder tumorprøver fra primære debulkingoperationer, efter neoadjuverende kemoterapi og fra tilbagevendende sygdom. Det rummer et værdifuldt potentiale for at fremme kræftforskning, der tjener som en ressource af lovende prognostiske biomarkører og terapeutiske mål³. Imidlertid er konventionelle biobankmetoder, såsom formalinfiksering og frysning, ikke modtagelige for at gennemføre funktionelle undersøgelser på de originale tumorprøver på grund af tab af levedygtighed og forstyrrelse af den oprindelige tredimensionelle vævsarkitektur ^4,5.

Undersøgelser af molekylære mekanismer, i onkologi og videre, afhænger afgørende af brugen af passende eksperimentelle modeller, der nøjagtigt afspejler sygdommens biologi og opretholder in vitro-egenskaber af det væv, der observeres in vivo. Patientafledte organoider, baseret på bevarelsen af fornyelsespotentialet, reproducerer i laboratoriet epithelets oprindelige struktur og funktion og tillader test i en patientspecifik sammenhæng. Derfor har de vist sig som meget lovende værktøjer til kræftforskning og personlig medicin, der bygger bro mellem klinisk mangfoldighed og laboratorieforskning 6,7,8,9. Skræddersyede terapeutiske strategier baseret på individuelle lægemiddelresponser af organoidlinjer og test af den funktionelle relevans af molekylære profiler kan potentielt anvendes direkte til patientpleje^10,11. Muligheden for langtidsdyrkning, herunder patientspecifikke karakteristika, og indsamling af relevante prospektive kliniske data over tid er meget lovende med hensyn til at identificere nye prognostiske og prædiktive faktorer, der er involveret i sygdomsprogression og resistensmekanismer ^3,9.

Ikke desto mindre kræver opbygning af en biobank, der inkluderer organoider fra forskellige tumorprøver, en kombination af streng overholdelse af kompleks metode og opsætning af protokoller for nem vedligeholdelse¹². Processtandardisering sikrer, at biobanken kan etableres og vedligeholdes effektivt af uddannet personale selv ved høj omsætning, samtidig med at de højeste kvalitetsstandarder^{overholdes 13}. Flere undersøgelser rapporterede den vellykkede generering af stabile organoide linjer for kræft i æggestokkene svarende til mutations- og fænotypisk profil af den oprindelige tumor med varierende effektivitetshastigheder. Alligevel er rutinemæssig biobank fortsat udfordrende i praksis, især for langsigtet stabil vækst af linjer, hvilket er en forudsætning for storstilet ekspansion eller vellykket genomisk redigering.

Især spørgsmålet om udvidelsesmuligheder er fortsat vagt defineret på området, da organoider, der viser langsomt og begrænset vækstpotentiale, lejlighedsvis tælles som etablerede linjer. Som oprindeligt påvist af Hoffmann et al., en undersøgelse, hvis hovedresultater dannede grundlag for denne videreudviklede protokol, kræver optimal håndtering af ovariecancervæv en unik strategi for at imødekomme heterogenitet¹⁴. Fænotypisk karakterisering af organoiderne opnået ved denne metode og tæt lighed med forældrenes tumorvæv blev bekræftet ved panel-DNA-sekventering og transkriptomisk analyse af modne kulturer (4-10 måneders dyrkning), der demonstrerer stabiliteten af modellen 8,9,12,14.

I modsætning til det parakrinmiljø, der regulerer homeostase i de sunde æggeledere, epitellaget, som sandsynligvis giver højkvalitets serøs ovariecancer (HGSOC), kræftregenereringspotentiale og organoid dannelseskapacitet, er mindre afhængig af eksogent Wnt-tilskud. Desuden viste aktiv knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalering, karakteriseret ved fraværet af Noggin i organoidmedium, sig at være gavnlig for etablering af langsigtede kulturer fra ovariecancer faste vævsaflejringer^14,15. Under systematisk biobanking af faste forekomster af kræft i æggestokkene har vi bekræftet disse resultater og oprettet rørledningen med detaljer skitseret i denne protokol, der sikrer vedvarende langsigtet ekspansion i de fleste tilfælde. Vi finder, at parallel afprøvning af forskellige mediesammensætninger og såningsmetoder, når der arbejdes med primære isolater, er afgørende for at forbedre etableringen af langsigtede stabile organoidlinjer og for at øge udbyttet, hvilket muliggør robust formering og udvidelse til multibrøndformater, der kræves til downstream-forsøg¹⁶.

Desuden er renheden og kvaliteten af de prøver, der indsamles under operationen, af afgørende betydning for translationspotentialet af ovariecancerorganoider i grundforskning og molekylær diagnostik. Kompleksiteten af den kliniske præsentation af HGSOC kræver et tæt samarbejde mellem kirurgerne, onkologerne og forskerne i laboratoriet for at sikre, at relevant materiale identificeres korrekt, transportbetingelserne holdes konstante, og organoide linjer genereres med høj effektivitet, der repræsenterer de vigtigste egenskaber ved sygdommen hos hver patient. Denne protokol giver en standardiseret, men tilpasningsdygtig ramme til at fange det fulde potentiale af ovariecancerorganoider i betragtning af den heterogenitet, der karakteriserer kræft i æggestokkene^16,17. Denne protokol muliggør især pålidelig biobanking af det brede spektrum af klinisk præsentation af kræft i æggestokkene, herunder forskellige histologiske typer (højkvalitets og lavgradig ovariecancer, LGSOC), forskellige aflejringer fra de samme patienter, der udviser forskelle i stemnessregulering, væv fra operationer i postneoadjuverende indstilling, biopsimateriale og prøver fra operationer i den tilbagevendende fase af sygdomsprogression.

Protocol

Tumorvævsprøver fra ovariecanceroperationer blev indsamlet, og patientafledte organoider blev genereret i overensstemmelse med den etiske komité for LMU University (17-471) i overensstemmelse med de eksisterende gældende EU-, nationale og lokale regler. Hver patient, der er involveret i undersøgelsen, har givet skriftligt samtykke. Ved arbejde med friske vævsprøver kræves biosikkerhedsniveau 2 sikkerhedstilladelse og Laminar Flow-skabe. I betragtning af vævsprøvernes potentielt infektiøse karakter, som ikke ka…

Representative Results

Efter indledende vævsdissociation, filtrering og tælling podes celler parallelt direkte i 3D-format, som forklaret ovenfor, såvel som suspensionen i kolben for kort 2D-ekspansion. I nogle tilfælde påvirker den forbigående 2D-ekspansion positivt organoiddannelsen, og den langsigtede linje etableres med succes via denne rute, mens komparativ parallel 3D-såning kan resultere i vækststop (figur 1). For hvert donorvæv, der behandles, testes cellerne i henhold til mediematrixen. Efter den…

Discussion

Den designede protokol adresserer tidligere udfordringer ved organoid biobanking af ovariecancer med hensyn til organoiddannelse og langsigtet passagepotentiale og sikrer generering af fuldt udvidelige linjer fra størstedelen af solide tumoraflejringer. Den kirurgiske indsamlingsproces af tumorprøver, der skal anvendes til organoidgenerering, påvirker udbyttet og ekspansionspotentialet betydeligt. Tumorvævsprøver kan opnås under forskellige procedurer, herunder multivisceral kirurgi, diagnostisk laparoskopi eller b…

Materials

100 Sterican 26 G	Braun, Melsungen, Germany	4657683
100 Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
293T HA Rspo1-Fc	R&D systems, Minneapolis, USA	3710-001-01	Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)	Merck, Darmstadt, Germany	616454
Advanced DMEM/F-12 Medium	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12634028
Anti-p53 antibody (DO1)	Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA	sc-126
Anti-PAX8 antibody	Proteintech, Manchester, UK	10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µm	Corning, Berlin, Germany	430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	658175
Collagenase I	Thermo Scientific, Waltham, USA	17018029
Costar 48-well Clear TC-treated	Corning, Berlin, Germany	3548
Cryo SFM	PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany	C-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear	R&D systems, Minneapolis, USA	3533-005-02	Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG	Jackson Immuno	715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	C9999-1000ML
DAPI	Thermo Scientific, Waltham, USA	62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel	Thermo Scientific, Waltham, USA	Epredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene	Corning, Berlin, Germany	351447
Feather scalpel	Pfm medical, Cologne, Germany	200130010
Fetal Bovine Serum	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	10270106
Formalin 37% acid free, stabilized	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1019205000
GlutaMAX	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	35050038
HEPES (1 M)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	156630080
Human EpCAM/TROP-1 Antibody	R&D systems, Minneapolis, USA	AF960
Human FGF10	Peprotech, NJ, USA	100-26
Human recombinant BMP2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHC7146
Human recombinant EGF	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1	Peprotech, NJ, USA	100-03
LAS X core Software	Leica Microsystems		https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope	Leica Microsystems
N-2 Supplement (100x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17502-048
Nicotinamide	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	N0636
Omnifix 1 mL	Braun, Melsungen, Germany	3570519
Paraffin
Parafilm	Omnilab, Munich, Germany	5170002
Paraformaldehyd	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1176201000
Pen Strep	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	P4333-100
PluriStrainer 400 µm	PluriSelect, Leipzig, Germany	43-50400-01
Primocin	InvivoGen, Toulouse, France	ant-pm-05
Red Blood Cell Lysing Buffer	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	11814389001
Roticlear	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	A538.5
Surgipath Paraplast	Leica, Wetzlar, Germany	39602012
Thermo Scientific Nunc Cryovials	Thermo Scientific, Waltham, USA	375418PK
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8787
Trypan Blue Stain	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8154
TrypLE Express Enzyme	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12604-013
Tween-20	PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany	A4974-0100
Y-27632	TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany	1254
Zeocin	Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA	R25001