Stratégie de mise en banque d’organoïdes du cancer de l’ovaire : Aborder l’hétérogénéité interpatiente entre les sous-types histologiques et les stades de la maladie
Summary
Ce protocole offre un cadre systématique pour l’établissement d’organoïdes du cancer de l’ovaire à différents stades de la maladie et relève les défis de la variabilité spécifique à la patiente pour augmenter le rendement et permettre une expansion robuste à long terme pour des applications ultérieures. Il comprend des étapes détaillées pour le traitement des tissus, l’ensemencement, l’ajustement des exigences en matière de milieux et la coloration par immunofluorescence.
Abstract
Bien que la création d’une biobanque du cancer de l’ovaire à partir d’organoïdes dérivés de patientes et de leurs informations cliniques de base promette des avancées dans la recherche et les soins aux patients, la normalisation reste un défi en raison de l’hétérogénéité de cette tumeur maligne mortelle, combinée à la complexité inhérente à la technologie des organoïdes. Ce protocole adaptable fournit un cadre systématique pour réaliser le plein potentiel des organoïdes du cancer de l’ovaire en tenant compte de la variabilité des progéniteurs spécifique à la patiente. En mettant en œuvre un flux de travail expérimental structuré pour sélectionner des conditions de culture et des méthodes de semis optimales, avec des tests parallèles de semis 3D direct par rapport à une voie 2D/3D, nous obtenons, dans la plupart des cas, des lignes d’expansion à long terme robustes adaptées à une large gamme d’applications en aval.
Notamment, le protocole a été testé et s’est avéré efficace dans un grand nombre de cas (N = 120) de matériel de départ très hétérogène, y compris le cancer de l’ovaire de haut et de bas grade et les stades de la maladie avec réduction tumorale primaire, maladie récurrente et échantillons chirurgicaux post-néoadjuvants. Dans un environnement de signalisation exogène à faible Wnt et à BMP élevé, nous avons observé que les progéniteurs étaient différemment sensibles à l’activation de la voie Heregulin 1 ß (HERß-1), HERß-1 favorisant la formation d’organoïdes chez certains tout en l’inhibant chez d’autres. Pour un sous-ensemble d’échantillons du patient, la formation optimale d’organoïdes et la croissance à long terme nécessitent l’ajout du facteur de croissance des fibroblastes 10 et de la R-Spondine 1 au milieu.
De plus, nous soulignons les étapes critiques de la digestion tissulaire et de l’isolement des progéniteurs et indiquons des exemples où une brève culture en 2D sur du plastique est bénéfique pour la formation ultérieure d’organoïdes dans la matrice de type 2 de l’extrait de membrane basale. Dans l’ensemble, une biobanque optimale nécessite des tests systématiques de toutes les principales conditions en parallèle afin d’identifier un environnement de croissance adéquat pour les lignées individuelles. Le protocole décrit également la procédure de manipulation pour un enrobage, une coupe et une coloration efficaces afin d’obtenir des images haute résolution des organoïdes, ce qui est nécessaire pour un phénotypage complet.
Introduction
La prise en charge clinique des patientes atteintes d’un cancer épithélial de l’ovaire reste difficile en raison de sa présentation clinique hétérogène à des stades avancés et de ses taux de récidive élevés1. Pour mieux comprendre le développement du cancer de l’ovaire et le comportement biologique, il faut des approches de recherche qui tiennent compte de la variabilité spécifique à la patiente au cours de la maladie, de la réponse au traitement et des caractéristiques histopathologiques et moléculaires2.
La biobanque, caractérisée par la collecte systématique et la conservation à long terme d’échantillons tumoraux provenant de patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire ainsi que de leurs informations cliniques, offre la préservation d’une large cohorte de patientes à différents stades de la maladie, y compris des échantillons tumoraux provenant de chirurgies primaires de réduction tumorale, après une chimiothérapie néoadjuvante et d’une maladie récurrente. Il présente un potentiel précieux pour faire progresser la recherche sur le cancer en tant que ressource de biomarqueurs pronostiques prometteurs et de cibles thérapeutiques3. Cependant, les méthodes conventionnelles de biobanque, telles que la fixation et la congélation du formol, ne se prêtent pas à la réalisation d’études fonctionnelles sur les échantillons tumoraux d’origine en raison de la perte de viabilité et de la perturbation de l’architecture tissulaire tridimensionnelle native 4,5.
Les études des mécanismes moléculaires, en oncologie et au-delà, dépendent de manière cruciale de l’utilisation de modèles expérimentaux appropriés qui reflètent fidèlement la biologie de la maladie et maintiennent les propriétés in vitro du tissu observé in vivo. Les organoïdes dérivés du patient, basés sur la préservation du potentiel de renouvellement, reproduisent en laboratoire la structure et la fonction d’origine de l’épithélium et permettent des tests dans un contexte spécifique au patient. Par conséquent, ils sont devenus des outils très prometteurs pour la recherche sur le cancer et la médecine personnalisée, comblant le fossé entre la diversité clinique et la recherche en laboratoire 6,7,8,9. Des stratégies thérapeutiques sur mesure basées sur les réponses médicamenteuses individuelles des lignées organoïdes et l’évaluation de la pertinence fonctionnelle des profils moléculaires peuvent potentiellement être appliquées directement aux soins aux patients10,11. La possibilité d’une culture à long terme incluant des caractéristiques spécifiques au patient et la collecte de données cliniques prospectives pertinentes au fil du temps est très prometteuse pour identifier de nouveaux facteurs pronostiques et prédictifs impliqués dans la progression de la maladie et les mécanismes de résistance 3,9.
Néanmoins, la construction d’une biobanque comprenant des organoïdes provenant de différents échantillons tumoraux nécessite une combinaison de respect strict d’une méthodologie complexe et de mise en place de protocoles pour une maintenance facile12. La standardisation des processus garantit que la biobanque peut être établie et entretenue efficacement par du personnel formé, même en cas de chiffre d’affaires élevé, tout en respectant les normes de qualité les plus élevées13. Plusieurs études ont rapporté la génération réussie de lignées organoïdes stables pour le cancer de l’ovaire correspondant au profil mutationnel et phénotypique de la tumeur d’origine avec des taux d’efficacité variables. Pourtant, la biobanque de routine reste difficile dans la pratique, en particulier pour la croissance stable à long terme des lignées, qui est une condition préalable à une expansion à grande échelle ou à une édition génomique réussie.
En particulier, la question de l’extensibilité reste vaguement définie sur le terrain car les organoïdes qui présentent un potentiel de croissance lent et limité sont parfois comptés comme des lignées établies. Comme l’ont initialement démontré Hoffmann et al., une étude dont les principaux résultats ont servi de base à ce protocole plus développé, la manipulation optimale du tissu cancéreux de l’ovaire nécessite une stratégie unique pour s’adapter à l’hétérogénéité14. La caractérisation phénotypique des organoïdes obtenus par cette méthode et l’étroite similitude avec le tissu tumoral parental ont été confirmées par le séquençage de l’ADN et l’analyse transcriptomique des cultures matures (4-10 mois de culture) démontrant la stabilité du modèle 8,9,12,14.
Contrairement à l’environnement paracrine qui régule l’homéostasie dans les trompes de Fallope saines, la couche épithéliale, qui produit probablement un cancer de l’ovaire séreux de haut grade (HGSOC), un potentiel de régénération du cancer et une capacité de formation d’organoïdes, est moins dépendante de la supplémentation exogène en Wnt. De plus, la signalisation active de la protéine morphogénétique osseuse (BMP), caractérisée par l’absence de Noggin dans le milieu organoïde, s’est avérée bénéfique pour l’établissement de cultures à long terme à partir de dépôts de tissus solides du cancer de l’ovaire14,15. Au cours de la biobanque systématique de dépôts solides de cancer de l’ovaire, nous avons confirmé ces résultats et mis en place le pipeline, avec des détails décrits dans ce protocole qui assure une expansion soutenue à long terme dans la majorité des cas. Nous constatons que les tests parallèles de différentes compositions de milieux et modalités d’ensemencement lors de l’utilisation d’isolats primaires sont essentiels pour améliorer l’établissement de lignées organoïdes stables à long terme et pour augmenter les rendements permettant une propagation robuste et une expansion vers des formats multipuits requis pour les expériences en aval16.
En outre, la pureté et la qualité des échantillons prélevés lors de la chirurgie sont d’une importance cruciale pour le potentiel translationnel des organoïdes du cancer de l’ovaire dans la recherche fondamentale et le diagnostic moléculaire. La complexité de la présentation clinique du HGSOC nécessite une coopération étroite entre les chirurgiens, les oncologues et les scientifiques du laboratoire pour s’assurer que le matériel pertinent est correctement identifié, que les conditions de transport sont maintenues constantes et que les lignées organoïdes sont générées avec une grande efficacité représentant les caractéristiques les plus importantes de la maladie de chaque patient. Ce protocole fournit un cadre standardisé mais adaptable pour saisir tout le potentiel des organoïdes du cancer de l’ovaire, compte tenu de l’hétérogénéité qui caractérise le cancer de l’ovaire16,17. Ce protocole permet notamment une biobanque fiable du large spectre de la présentation clinique du cancer de l’ovaire, y compris différents types histologiques (cancer de l’ovaire de haut grade et de bas grade, LGSOC), différents dépôts provenant des mêmes patientes qui présentent des différences dans la régulation de la souche, des tissus provenant de chirurgies en contexte post-néoadjuvant, du matériel de biopsie et des échantillons de chirurgies dans la phase récurrente de progression de la maladie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole conçu répond aux défis précédents de la biobanque d’organoïdes du cancer de l’ovaire en ce qui concerne la formation d’organoïdes et le potentiel de passage à long terme et garantit la génération de lignées entièrement extensibles à partir de la majorité des dépôts tumoraux solides. Le processus de collecte chirurgicale d’échantillons tumoraux à utiliser pour la génération d’organoïdes a un impact significatif sur le rendement et le potentiel d’expansion. Des échantillons de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude est financée par le Centre allemand de recherche sur le cancer DKTK, le site partenaire de Munich, un partenariat entre DKFZ et l’hôpital universitaire LMU Munich. L’étude est également soutenue par la subvention allemande Cancer Aid (#70113426 et #70113433). L’enrobage de paraffine de tissus et d’organoïdes a été effectué à la plateforme de l’Institut d’anatomie de la Faculté de médecine de la LMU de Munich. L’imagerie confocale a été réalisée à la plateforme de bioimagerie du Centre biomédical (BMC). Les auteurs tiennent à remercier Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink et Martina Rahmeh, pour leur aide technique.
Materials
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
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