डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड के बायोबैंकिंग के लिए रणनीति: हिस्टोलॉजिकल उपप्रकारों और रोग चरणों में इंटरपेशेंट विषमता को संबोधित करना
Summary
यह प्रोटोकॉल विभिन्न रोग चरणों से डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड की स्थापना के लिए एक व्यवस्थित ढांचा प्रदान करता है और उपज बढ़ाने और बाद के अनुप्रयोगों के लिए मजबूत दीर्घकालिक विस्तार को सक्षम करने के लिए रोगी-विशिष्ट परिवर्तनशीलता की चुनौतियों का समाधान करता है। इसमें ऊतक प्रसंस्करण, बीजारोपण, मीडिया आवश्यकताओं को समायोजित करने और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के लिए विस्तृत कदम शामिल हैं।
Abstract
जबकि रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड से डिम्बग्रंथि के कैंसर बायोबैंक की स्थापना उनके नैदानिक पृष्ठभूमि की जानकारी के साथ अनुसंधान और रोगी देखभाल में प्रगति का वादा करती है, इस घातक दुर्दमता की विषमता के कारण मानकीकरण एक चुनौती बनी हुई है, जो ऑर्गेनॉइड तकनीक की अंतर्निहित जटिलता के साथ संयुक्त है। यह अनुकूलनीय प्रोटोकॉल डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड की पूरी क्षमता का एहसास करने के लिए एक व्यवस्थित ढांचा प्रदान करता है, जो पूर्वजों की रोगी-विशिष्ट परिवर्तनशीलता पर विचार करता है। इष्टतम संस्कृति की स्थिति और बोने के तरीकों का चयन करने के लिए एक संरचित प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो को लागू करके, प्रत्यक्ष 3 डी सीडिंग बनाम 2 डी / 3 डी मार्ग के समानांतर परीक्षण के साथ, हम ज्यादातर मामलों में, डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त मजबूत दीर्घकालिक विस्तार लाइनें प्राप्त करते हैं।
विशेष रूप से, प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया है और अत्यधिक विषम प्रारंभिक सामग्री के मामलों (एन = 120) की एक बड़ी संख्या में कुशल साबित हुआ है, जिसमें उच्च ग्रेड और निम्न-ग्रेड डिम्बग्रंथि के कैंसर और प्राथमिक डिबल्किंग, आवर्तक बीमारी और पोस्ट-नियोएडजुवेंट सर्जिकल नमूनों के साथ रोग के चरण शामिल हैं। कम Wnt, उच्च BMP बहिर्जात सिग्नलिंग वातावरण के भीतर, हमने देखा कि पूर्वज हेरेगुलिन 1 ß (HERß-1) -पाथवे के सक्रियण के लिए अलग-अलग अतिसंवेदनशील होते हैं, HERß-1 कुछ में ऑर्गेनॉइड गठन को बढ़ावा देते हैं जबकि इसे दूसरों में रोकते हैं। रोगी के नमूनों के एक सबसेट के लिए, इष्टतम ऑर्गेनॉइड गठन और दीर्घकालिक विकास के लिए माध्यम में फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 10 और आर-स्पोंडिन 1 के अतिरिक्त की आवश्यकता होती है।
इसके अलावा, हम ऊतक पाचन और पूर्वज अलगाव के महत्वपूर्ण चरणों पर प्रकाश डालते हैं और उन उदाहरणों को इंगित करते हैं जहां प्लास्टिक पर 2 डी में संक्षिप्त खेती बेसमेंट मेम्ब्रेन एक्सट्रैक्ट टाइप 2 मैट्रिक्स में बाद के ऑर्गेनॉइड गठन के लिए फायदेमंद है। कुल मिलाकर, इष्टतम बायोबैंकिंग को व्यक्तिगत लाइनों के लिए पर्याप्त विकास वातावरण की पहचान करने के लिए समानांतर में सभी मुख्य स्थितियों के व्यवस्थित परीक्षण की आवश्यकता होती है। प्रोटोकॉल भी व्यापक फेनोटाइपिंग के लिए आवश्यक है जो organoids, जो उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए कुशल एम्बेडिंग, sectioning, और धुंधला के लिए हैंडलिंग प्रक्रिया का वर्णन करता है.
Introduction
उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर के साथ रोगियों के नैदानिक प्रबंधन उन्नत चरणों और उच्चपुनरावृत्ति दर 1 पर अपनी विषम नैदानिक प्रस्तुति के कारण चुनौतीपूर्ण बनी हुई है. डिम्बग्रंथि के कैंसर के विकास और जैविक व्यवहार की हमारी समझ में सुधार के लिए अनुसंधान दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है जो रोग, उपचार प्रतिक्रिया, और हिस्टोपैथोलॉजिकल के साथ-साथ आणविक विशेषताओं के दौरान रोगी-विशिष्ट परिवर्तनशीलता को संबोधित करतेहैं।
बायोबैंकिंग, डिम्बग्रंथि के कैंसर रोगियों से प्राप्त ट्यूमर के नमूनों के व्यवस्थित संग्रह और दीर्घकालिक संरक्षण की विशेषता है, साथ ही उनकी नैदानिक जानकारी विभिन्न रोग चरणों में एक बड़े रोगी कोहोर्ट का संरक्षण प्रदान करती है, जिसमें प्राथमिक डिबलिंग सर्जरी से ट्यूमर के नमूने, नियोएडजुवेंट कीमोथेरेपी के बाद और आवर्तक बीमारी से। यह होनहार रोगनिरोधी बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्य 3 के संसाधन के रूप में सेवारत कैंसर अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए मूल्यवान क्षमता रखतीहै। हालांकि, इस तरह के formalin निर्धारण और ठंड के रूप में पारंपरिक बायोबैंकिंग विधियों, व्यवहार्यता के नुकसान और देशी तीन आयामी ऊतक वास्तुकला 4,5 के विघटन के कारण मूल ट्यूमर के नमूनों पर कार्यात्मक अध्ययन आयोजित करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं.
ऑन्कोलॉजी और उससे आगे आणविक तंत्र का अध्ययन, महत्वपूर्ण रूप से उपयुक्त प्रयोगात्मक मॉडल के उपयोग पर निर्भर करता है जो ईमानदारी से रोग के जीव विज्ञान को प्रतिबिंबित करता है और विवो में देखे गए ऊतक के इन विट्रो गुणों को बनाए रखता है। रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स, नवीकरण क्षमता के संरक्षण के आधार पर, प्रयोगशाला में उपकला की मूल संरचना और कार्य को पुन: पेश करते हैं और रोगी-विशिष्ट संदर्भ में परीक्षण की अनुमति देते हैं। इसलिए, वे कैंसर अनुसंधान और व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए अत्यधिक आशाजनक उपकरण के रूप में उभरा है, नैदानिक विविधता और प्रयोगशाला अनुसंधान 6,7,8,9 के बीच की खाई को पाटने. ऑर्गेनोइड लाइनों की व्यक्तिगत दवा प्रतिक्रियाओं और आणविक प्रोफाइल की कार्यात्मक प्रासंगिकता के परीक्षण के आधार पर अनुरूप चिकित्सीय रणनीतियों, संभावित रूप से सीधे रोगी देखभाल10,11 पर लागू किया जा सकता है। रोगी विशिष्ट विशेषताओं और समय के साथ प्रासंगिक भावी नैदानिक डेटा के संग्रह सहित लंबी अवधि की खेती की संभावना उपन्यास रोगनिरोधी और रोग प्रगति और प्रतिरोध तंत्र 3,9 में शामिल भविष्य कहनेवाला कारकों की पहचान करने के लिए महान वादा रखती है.
बहरहाल, एक बायोबैंक है कि विभिन्न ट्यूमर नमूनों से organoids शामिल बनाने जटिल पद्धति के लिए सख्त पालन और आसान रखरखाव12 के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना की एक संयोजन की आवश्यकता है. प्रक्रिया मानकीकरण यह सुनिश्चित करता है कि बायोबैंक को उच्च कारोबार पर भी प्रशिक्षित कर्मचारियों द्वारा कुशलतापूर्वक स्थापित और बनाए रखा जा सकता है, जबकि एक ही समय में उच्चतम गुणवत्ता मानकों का पालन करना13. कई अध्ययनों ने अलग-अलग दक्षता दरों के साथ मूल ट्यूमर के उत्परिवर्ती और फेनोटाइपिकल प्रोफाइल के अनुरूप स्थिर डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनॉइड लाइनों की सफल पीढ़ी की सूचना दी। फिर भी, नियमित जैव बैंकिंग व्यवहार में चुनौतीपूर्ण बनी हुई है, विशेष रूप से लाइनों के दीर्घकालिक स्थिर विकास के लिए, जो बड़े पैमाने पर विस्तार या सफल जीनोमिक संपादन के लिए एक शर्त है।
विशेष रूप से, विस्तारशीलता का मुद्दा क्षेत्र में अस्पष्ट रूप से परिभाषित रहता है क्योंकि धीमी और सीमित विकास क्षमता दिखाने वाले ऑर्गेनोइड को कभी-कभी स्थापित लाइनों के रूप में गिना जाता है। के रूप में शुरू में हॉफमैन एट अल द्वारा प्रदर्शन किया, एक अध्ययन जिसका प्रमुख निष्कर्षों इस आगे विकसित प्रोटोकॉल के लिए आधार प्रदान की, डिम्बग्रंथि के कैंसर ऊतक के इष्टतम हैंडलिंग विषमता14 को समायोजित करने के लिए एक अनूठी रणनीति की आवश्यकता है. इस विधि द्वारा प्राप्त ऑर्गेनोइड के फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन और माता-पिता के ट्यूमर ऊतक के साथ घनिष्ठ समानता की पुष्टि पैनल डीएनए अनुक्रमण और परिपक्व संस्कृतियों (खेती के 4-10 महीने) के ट्रांसक्रिप्टोमिक्स विश्लेषण द्वारा की गई थी, जो मॉडल 8,9,12,14की स्थिरता का प्रदर्शन करती है।
पैराक्राइन वातावरण के विपरीत जो स्वस्थ फैलोपियन ट्यूबों में होमियोस्टैसिस को नियंत्रित करता है, उपकला परत, जो संभवतः उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर (एचजीएसओसी), कैंसर पुनर्जनन क्षमता और ऑर्गेनॉइड गठन क्षमता पैदा करती है, बहिर्जात डब्ल्यूएनटी पूरकता पर कम निर्भर है। इसके अलावा, सक्रिय अस्थि morphogenetic प्रोटीन (बीएमपी) संकेतन, organoid माध्यम में Noggin की अनुपस्थिति की विशेषता है, डिम्बग्रंथि के कैंसर ठोस ऊतक जमा14,15 से दीर्घकालिक संस्कृतियों की स्थापना के लिए फायदेमंद साबित हुई. डिम्बग्रंथि के कैंसर के ठोस जमा के व्यवस्थित बायोबैंकिंग के दौरान, हमने इन निष्कर्षों की पुष्टि की है और पाइपलाइन की स्थापना की है, इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विवरण के साथ जो अधिकांश मामलों में निरंतर दीर्घकालिक विस्तार सुनिश्चित करता है। हम पाते हैं कि प्राथमिक आइसोलेट्स के साथ काम करते समय विभिन्न मीडिया रचनाओं और बोने के तौर-तरीकों के समानांतर परीक्षण दीर्घकालिक स्थिर ऑर्गेनॉइड लाइनों की स्थापना में सुधार करने और पैदावार बढ़ाने के लिए आवश्यकहैं, जिससे डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए आवश्यक बहु-अच्छी तरह से प्रारूपों में मजबूत प्रसार और विस्तार को सक्षम किया जा सके।
इसके अलावा, सर्जरी के दौरान एकत्र किए गए नमूनों की शुद्धता और गुणवत्ता बुनियादी अनुसंधान और आणविक निदान में डिम्बग्रंथि के कैंसर के अंगों की अनुवाद क्षमता के लिए महत्वपूर्ण महत्व है। एचजीएसओसी की नैदानिक प्रस्तुति की जटिलता को सर्जनों, ऑन्कोलॉजिस्ट और प्रयोगशाला में वैज्ञानिकों के बीच घनिष्ठ सहयोग की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रासंगिक सामग्री की सही पहचान की गई है, परिवहन की स्थिति स्थिर रखी जाती है, और ऑर्गेनॉइड लाइनें उच्च दक्षता के साथ उत्पन्न होती हैं जो सबसे महत्वपूर्ण विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करती हैं प्रत्येक रोगी की बीमारी। यह प्रोटोकॉल डिम्बग्रंथि के कैंसर 16,17की विशेषता वाली विषमता पर विचार करते हुए, डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड की पूरी क्षमता को पकड़ने के लिए एक मानकीकृत लेकिन अनुकूलनीय ढांचा प्रदान करता है। विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल डिम्बग्रंथि के कैंसर नैदानिक प्रस्तुति के व्यापक स्पेक्ट्रम के विश्वसनीय बायोबैंकिंग को सक्षम बनाता है, जिसमें विभिन्न हिस्टोलॉजिकल प्रकार (उच्च ग्रेड और निम्न-ग्रेड डिम्बग्रंथि के कैंसर, एलजीएसओसी) शामिल हैं, एक ही रोगियों से अलग-अलग जमा जो स्टेमनेस विनियमन में अंतर प्रदर्शित करते हैं, पोस्ट नियोएडजुवेंट सेटिंग में सर्जरी से ऊतक, बायोप्सी सामग्री, और रोग प्रगति के आवर्तक चरण में सर्जरी से नमूने।
Protocol
Representative Results
Discussion
डिज़ाइन किया गया प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड गठन और दीर्घकालिक मार्ग क्षमता के संबंध में डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनॉइड बायोबैंकिंग की पिछली चुनौतियों को संबोधित करता है और ठोस ट्यूमर जमा के बहुमत से पूरी ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अध्ययन जर्मन कैंसर रिसर्च सेंटर DKTK, पार्टनर साइट म्यूनिख, DKFZ और यूनिवर्सिटी अस्पताल LMU म्यूनिख के बीच एक साझेदारी द्वारा वित्त पोषित है। अध्ययन जर्मन कैंसर सहायता अनुदान (#70113426 और #70113433) द्वारा भी समर्थित है। ऊतक और ऑर्गेनोइड के पैराफिन एम्बेडिंग को एनाटॉमी संस्थान, चिकित्सा संकाय, एलएमयू म्यूनिख, म्यूनिख की कोर सुविधा में किया गया है। बायोमेडिकल सेंटर (बीएमसी) में कोर सुविधा बायोइमेजिंग में कंफोकल इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया है। लेखक तकनीकी सहायता के लिए सिमोन हॉफमैन, मारिया फिशर, कॉर्नेलिया हर्बस्ट, सबाइन फिंक और मार्टिना रहमेह को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
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