Strategia per la biobanca degli organoidi del carcinoma ovarico: affrontare l'eterogeneità interpaziente tra sottotipi istologici e stadi di malattia
Summary
Questo protocollo offre un quadro sistematico per la creazione di organoidi di carcinoma ovarico provenienti da diversi stadi di malattia e affronta le sfide della variabilità specifica del paziente per aumentare la resa e consentire una robusta espansione a lungo termine per le applicazioni successive. Include passaggi dettagliati per la lavorazione dei tessuti, la semina, la regolazione dei requisiti dei terreni e la colorazione in immunofluorescenza.
Abstract
Mentre la creazione di una biobanca per il cancro ovarico a partire da organoidi derivati da pazienti insieme alle loro informazioni cliniche di base promette progressi nella ricerca e nella cura dei pazienti, la standardizzazione rimane una sfida a causa dell’eterogeneità di questa neoplasia maligna letale, combinata con la complessità intrinseca della tecnologia degli organoidi. Questo protocollo adattabile fornisce un quadro sistematico per realizzare il pieno potenziale degli organoidi del carcinoma ovarico considerando una variabilità dei progenitori specifica per il paziente. Implementando un flusso di lavoro sperimentale strutturato per selezionare le condizioni di coltura e i metodi di semina ottimali, con test paralleli della semina 3D diretta rispetto a un percorso 2D/3D, otteniamo, nella maggior parte dei casi, robuste linee di espansione a lungo termine adatte a un’ampia gamma di applicazioni a valle.
In particolare, il protocollo è stato testato e si è dimostrato efficace in un gran numero di casi (N = 120) di materiale di partenza altamente eterogeneo, tra cui carcinoma ovarico di alto e basso grado e stadi della malattia con debulking primario, malattia ricorrente e campioni chirurgici post-neoadiuvanti. All’interno di un ambiente di segnalazione esogena a basso Wnt e alto BMP, abbiamo osservato che i progenitori sono diversamente suscettibili all’attivazione della via Heregulin 1 ß (HERß-1), con HERß-1 che promuove la formazione di organoidi in alcuni mentre la inibe in altri. Per un sottoinsieme dei campioni del paziente, la formazione ottimale di organoidi e la crescita a lungo termine richiedono l’aggiunta del fattore di crescita dei fibroblasti 10 e della R-Spondina 1 al terreno.
Inoltre, evidenziamo le fasi critiche della digestione tissutale e dell’isolamento dei progenitori e indichiamo esempi in cui una breve coltivazione in 2D su plastica è vantaggiosa per la successiva formazione di organoidi nella matrice di tipo 2 dell’estratto di membrana basale. Nel complesso, un biobanking ottimale richiede test sistematici di tutte le principali condizioni in parallelo per identificare un ambiente di crescita adeguato per le singole linee. Il protocollo descrive anche la procedura di gestione per l’inclusione, il sezionamento e la colorazione efficienti per ottenere immagini ad alta risoluzione degli organoidi, necessarie per una fenotipizzazione completa.
Introduction
La gestione clinica delle pazienti con carcinoma ovarico epiteliale rimane impegnativa a causa della sua presentazione clinica eterogenea in stadi avanzati e degli alti tassi di recidiva1. Migliorare la nostra comprensione dello sviluppo del carcinoma ovarico e del comportamento biologico richiede approcci di ricerca che affrontino la variabilità specifica del paziente durante il decorso della malattia, la risposta al trattamento e le caratteristiche istopatologiche e molecolari2.
La biobanca, caratterizzata dalla raccolta sistematica e dalla conservazione a lungo termine di campioni tumorali derivati da pazienti con carcinoma ovarico insieme alle loro informazioni cliniche, offre la conservazione di un’ampia coorte di pazienti in diversi stadi di malattia, compresi campioni tumorali provenienti da interventi chirurgici primari di debulking, dopo chemioterapia neoadiuvante e da malattia ricorrente. Possiede un potenziale prezioso per far progredire la ricerca sul cancro, fungendo da risorsa di promettenti biomarcatori prognostici e bersagli terapeutici3. Tuttavia, i metodi convenzionali di biobanca, come la fissazione e il congelamento della formalina, non sono suscettibili di condurre studi funzionali sui campioni tumorali originali a causa della perdita di vitalità e della rottura dell’architettura tissutale tridimensionale nativa 4,5.
Gli studi sui meccanismi molecolari, in oncologia e non solo, dipendono in modo cruciale dall’utilizzo di opportuni modelli sperimentali che riflettano fedelmente la biologia della malattia e mantengano in vitro le proprietà del tessuto osservato in vivo. Gli organoidi derivati dal paziente, basati sulla conservazione del potenziale di rinnovamento, riproducono in laboratorio la struttura e la funzione originali dell’epitelio e consentono di eseguire test in un contesto specifico per il paziente. Pertanto, sono emersi come strumenti molto promettenti per la ricerca sul cancro e la medicina personalizzata, colmando il divario tra la diversità clinica e la ricerca di laboratorio 6,7,8,9. Strategie terapeutiche personalizzate basate sulle risposte farmacologiche individuali delle linee di organoidi e sulla verifica della rilevanza funzionale dei profili molecolari possono essere potenzialmente applicate direttamente alla cura del paziente10,11. La possibilità di una coltivazione a lungo termine che includa le caratteristiche specifiche del paziente e la raccolta di dati clinici prospettici rilevanti nel tempo è molto promettente per identificare nuovi fattori prognostici e predittivi coinvolti nella progressione della malattia e nei meccanismi di resistenza 3,9.
Ciononostante, la costruzione di una biobanca che includa organoidi provenienti da diversi campioni tumorali richiede una combinazione di stretta aderenza a una metodologia complessa e la creazione di protocolli per una facile manutenzione12. La standardizzazione dei processi garantisce che la biobanca possa essere costituita e mantenuta in modo efficiente da personale qualificato anche in caso di elevato turnover, rispettando allo stesso tempo i più elevati standard di qualità13. Diversi studi hanno riportato il successo della generazione di linee di organoidi stabili per carcinoma ovarico corrispondenti al profilo mutazionale e fenotipico del tumore originale con tassi di efficienza variabili. Tuttavia, la biobanca di routine rimane impegnativa nella pratica, in particolare per la crescita stabile a lungo termine delle linee, che è un prerequisito per l’espansione su larga scala o per il successo dell’editing genomico.
In particolare, la questione dell’espandibilità rimane vagamente definita nel campo in quanto gli organoidi che mostrano un potenziale di crescita lento e limitato sono occasionalmente conteggiati come linee stabilite. Come inizialmente dimostrato da Hoffmann et al., uno studio i cui principali risultati hanno fornito la base per questo protocollo ulteriormente sviluppato, la gestione ottimale del tessuto del carcinoma ovarico richiede una strategia unica per adattarsi all’eterogeneità14. La caratterizzazione fenotipica degli organoidi ottenuti con questo metodo e la stretta somiglianza con il tessuto tumorale parentale sono state confermate dal sequenziamento del DNA del pannello e dall’analisi trascrittomica di colture mature (4-10 mesi di coltivazione) dimostrando la stabilità del modello 8,9,12,14.
In contrasto con l’ambiente paracrino che regola l’omeostasi nelle tube di Falloppio sane, lo strato epiteliale, che probabilmente produce il carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC), il potenziale di rigenerazione del cancro e la capacità di formazione di organoidi, è meno dipendente dall’integrazione esogena di Wnt. Inoltre, la segnalazione attiva della proteina morfogenetica ossea (BMP), caratterizzata dall’assenza di Noggin nel terreno organoide, si è dimostrata utile per la creazione di colture a lungo termine da depositi di tessuto solido del cancro ovarico14,15. Durante il biobanking sistematico dei depositi solidi di carcinoma ovarico, abbiamo confermato questi risultati e impostato la pipeline, con i dettagli delineati in questo protocollo che garantisce un’espansione sostenuta a lungo termine nella maggior parte dei casi. Riteniamo che i test paralleli di diverse composizioni di terreni e modalità di semina quando si lavora con isolati primari siano essenziali per migliorare la creazione di linee di organoidi stabili a lungo termine e per aumentare le rese consentendo una propagazione robusta e l’espansione in formati multi-pozzetto necessari per gli esperimenti a valle16.
Inoltre, la purezza e la qualità dei campioni raccolti durante l’intervento chirurgico sono di fondamentale importanza per il potenziale traslazionale degli organoidi del carcinoma ovarico nella ricerca di base e nella diagnostica molecolare. La complessità della presentazione clinica dell’HGSOC richiede una stretta collaborazione tra i chirurghi, gli oncologi e gli scienziati in laboratorio per garantire che il materiale pertinente sia correttamente identificato, che le condizioni di trasporto siano mantenute costanti e che le linee di organoidi siano generate con elevata efficienza che rappresentano le caratteristiche più importanti della malattia di ciascun paziente. Questo protocollo fornisce un quadro standardizzato ma adattabile per catturare il pieno potenziale degli organoidi del carcinoma ovarico, considerando l’eterogeneità che caratterizza il carcinoma ovarico16,17. In particolare, questo protocollo consente un biobanking affidabile dell’ampio spettro della presentazione clinica del carcinoma ovarico, compresi diversi tipi istologici (carcinoma ovarico di alto e basso grado, LGSOC), diversi depositi delle stesse pazienti che presentano differenze nella regolazione della staminalità, tessuti provenienti da interventi chirurgici in ambito post-neoadiuvante, materiale bioptico e campioni provenienti da interventi chirurgici nella fase ricorrente della progressione della malattia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo progettato affronta le precedenti sfide del biobanking degli organoidi del cancro ovarico per quanto riguarda la formazione di organoidi e il potenziale di passaggio a lungo termine e garantisce la generazione di linee completamente espandibili dalla maggior parte dei depositi di tumori solidi. Il processo chirurgico di raccolta dei campioni tumorali da utilizzare per la generazione di organoidi ha un impatto significativo sulla resa e sul potenziale di espansione. I campioni di tessuto tumorale possono ess…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è finanziato dal Centro tedesco di ricerca sul cancro DKTK, dal sito partner di Monaco di Baviera, da una partnership tra DKFZ e dall’Ospedale universitario LMU di Monaco di Baviera. Lo studio è sostenuto anche dalla sovvenzione tedesca Cancer Aid (#70113426 e #70113433). L’inclusione in paraffina di tessuti e organoidi è stata eseguita presso la struttura Core dell’Istituto di Anatomia, Facoltà di Medicina, LMU Monaco di Baviera, Monaco di Baviera. L’imaging confocale è stato eseguito presso la struttura Core Bioimaging presso il Biomedical Center (BMC). Gli autori desiderano ringraziare Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink e Martina Rahmeh per l’aiuto tecnico.
Materials
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
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