卵巣がんオルガノイドのバイオバンキング戦略:組織学的サブタイプと疾患病期にわたる患者間の不均一性への対処
Summary
このプロトコルは、さまざまな病期からの卵巣がんオルガノイドを確立するための体系的なフレームワークを提供し、患者固有の変動性の課題に対処して、収量を増やし、その後のアプリケーションのための堅牢な長期拡張を可能にします。これには、組織処理、播種、培地要件の調整、および免疫蛍光染色の詳細な手順が含まれています。
Abstract
患者由来のオルガノイドとその臨床的背景情報から卵巣がんバイオバンクを確立することは、研究と患者ケアの進歩を約束しますが、この致死的な悪性腫瘍の不均一性とオルガノイド技術の固有の複雑さが組み合わさったため、標準化は依然として課題です。この適応可能なプロトコルは、前駆細胞の患者固有の変動性を考慮して、卵巣がんオルガノイドの可能性を最大限に引き出すための体系的なフレームワークを提供します。最適な培養条件と播種方法を選択するための構造化された実験ワークフローを実装し、直接3D播種と2D/3Dルートの並列試験を行うことで、ほとんどの場合、幅広いダウンストリームアプリケーションに適した堅牢な長期増殖ラインが得られます。
特に、このプロトコルは、高悪性度および低悪性度の卵巣癌や、一次減量、再発性疾患、および術前補助術後の手術標本を伴う疾患の病期など、非常に不均一な出発物質の多数の症例(N = 120)でテストされ、有効であることが証明されています。低Wnt、高BMPの外因性シグナル伝達環境内では、前駆細胞がヘレグリン1β(HERβ-1)経路の活性化に対して異なる感受性を示し、HERβ-1がオルガノイド形成を促進するものと阻害するものがあることが観察されました。患者のサンプルのサブセットでは、最適なオルガノイド形成と長期増殖のために、線維芽細胞増殖因子10およびR-Spondin 1を培地に添加する必要があります。
さらに、組織消化と前駆細胞の単離の重要なステップを強調し、プラスチック上での2Dでの短時間の培養が、基底膜抽出物2型マトリックスにおけるその後のオルガノイド形成に有益である例を指摘します。全体として、最適なバイオバンキングには、個々のラインの適切な成長環境を特定するために、すべての主要な条件を並行して体系的にテストする必要があります。また、このプロトコルでは、包括的な表現型解析に必要なオルガノイドの高解像度画像を取得するための効率的な包埋、切片化、染色の処理手順についても説明しています。
Introduction
上皮性卵巣がん患者の臨床管理は、進行期における臨床症状の不均一性および再発率の高さにより、依然として困難である1。卵巣がんの発生と生物学的挙動の理解を深めるには、疾患の経過中の患者固有の変動性、治療反応、病理組織学的および分子的特徴に対処する研究アプローチが必要です2。
バイオバンキングは、卵巣がん患者に由来する腫瘍サンプルとその臨床情報を体系的に収集し、長期保存することを特徴としており、一次減量手術、ネオアジュバント化学療法後、再発性疾患からの腫瘍サンプルなど、さまざまな疾患ステージの大規模な患者コホートの保存を提供します。がん研究を前進させる貴重な可能性を秘めており、有望な予後バイオマーカーや治療標的のリソースとして機能します3。しかし、ホルマリンの固定や凍結などの従来のバイオバンキング法は、生存率の喪失と天然の3次元組織構造の破壊のために、元の腫瘍サンプルの機能研究を行うのに適していません4,5。
腫瘍学およびそれ以外の分野における分子メカニズムの研究は、疾患の生物学を忠実に反映し、in vivoで観察された組織のin vitro特性を維持する適切な実験モデルの使用に決定的に依存しています。患者由来のオルガノイドは、再生能の保存に基づいて、上皮の元の構造と機能を実験室で再現し、患者固有の状況での検査を可能にします。したがって、それらは癌研究と個別化医療のための非常に有望なツールとして浮上しており、臨床的多様性と実験室研究の間のギャップを埋めています6,7,8,9。オルガノイド株の個々の薬物反応と分子プロファイルの機能的関連性の試験に基づいて調整された治療戦略は、患者ケアに直接適用できる可能性があります10,11。患者固有の特性を含む長期的な培養の可能性と、関連する前向き臨床データの収集は、疾患の進行と耐性メカニズムに関与する新しい予後および予測因子を特定する上で大きな期待を寄せています3,9。
それにもかかわらず、異なる腫瘍サンプルからのオルガノイドを含むバイオバンクを構築するには、複雑な方法論の厳守と、メンテナンスを容易にするためのプロトコルの設定を組み合わせる必要があります12。プロセスの標準化により、高い離職率でも訓練を受けたスタッフがバイオバンクを効率的に確立および維持できると同時に、最高の品質基準を順守することができます13。いくつかの研究で、元の腫瘍の突然変異および表現型プロファイルに対応する安定した卵巣がんオルガノイド株の作製に成功したことが報告されているが、効率はさまざまである。しかし、日常的なバイオバンキングは、特に大規模な拡大やゲノム編集の成功の前提条件であるラインの長期安定的な成長のためには、実際には依然として課題となっています。
特に、拡張性の問題は、成長が遅く、限られた成長の可能性を示すオルガノイドが確立された系統としてカウントされることがあるため、この分野では曖昧なままです。Hoffmannらによって最初に実証されたように、その主要な発見がこのさらに開発されたプロトコルの基礎を提供した研究、卵巣癌組織の最適な取り扱いには、不均一性に対応するための独自の戦略が必要です14。この方法によって得られたオルガノイドの表現型特性評価および親腫瘍組織との密接な類似性は、成熟培養物(4〜10か月の培養)のパネルDNAシーケンシングおよびトランスクリプトミクス分析によって確認され、モデルの安定性が実証されました8,9,12,14。
健康な卵管の恒常性を調節するパラクリン環境とは対照的に、高悪性度漿液性卵巣がん(HGSOC)、がん再生能、およびオルガノイド形成能力をもたらす可能性が高い上皮層は、外因性Wnt補給への依存度が低い。さらに、オルガノイド培地にノギンが存在しないことを特徴とする活性骨形態形成タンパク質(BMP)シグナル伝達は、卵巣癌の固形組織沈着物からの長期培養の確立に有益であることが証明されました14,15。卵巣がんの固形沈着物の体系的なバイオバンキング中に、私たちはこれらの発見を確認し、パイプラインを設定し、このプロトコルで詳細を概説することで、大部分の症例で持続的な長期拡大を保証します。一次単離株を扱う場合、異なる培地組成と播種モダリティの並行試験は、長期安定オルガノイド株の確立を改善し、収率を高め、下流の実験に必要なマルチウェルフォーマットへの堅牢な増殖と増殖を可能にするために不可欠であることがわかりました16。
さらに、手術中に採取されたサンプルの純度と品質は、基礎研究や分子診断における卵巣がんオルガノイドのトランスレーショナルポテンシャルにとって非常に重要です。HGSOCの臨床症状は複雑であるため、外科医、腫瘍医、およびラボの科学者が緊密に協力して、関連する材料を正しく識別し、輸送条件を一定に保ち、各患者の疾患の最も重要な特徴を表すオルガノイド株を高効率で生成する必要があります。このプロトコルは、卵巣がんを特徴づける不均一性を考慮して、卵巣がんオルガノイドの可能性を最大限に引き出すための標準化された適応可能なフレームワークを提供します16,17。特に、このプロトコルは、さまざまな組織型(高悪性度および低悪性度卵巣がん、LGSOC)、幹細胞性調節に違いを示す同じ患者からの異なる沈着物、ネオアジュバント後の手術からの組織、生検材料、および疾患進行の再発期の手術からのサンプルを含む、幅広い卵巣がんの臨床症状の信頼性の高いバイオバンキングを可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
設計されたプロトコルは、オルガノイド形成と長期継代の可能性に関する卵巣がんオルガノイドバイオバンキングの以前の課題に対処し、固形腫瘍沈着物の大部分から完全に拡張可能なラインの生成を保証します。オルガノイドの生成に使用される腫瘍サンプルの外科的収集プロセスは、収量と増殖の可能性に大きく影響します。腫瘍組織サンプルは、多臓手術、診断的腹腔鏡検査、生検な?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、DKFZとミュンヘン大学病院LMUのパートナーシップであるドイツがん研究センターDKTK、パートナーサイトミュンヘンから資金提供を受けています。この研究は、ドイツのがん援助助成金(#70113426および#70113433)によっても支援されています。組織とオルガノイドのパラフィン包埋は、ミュンヘンのLMUミュンヘンにある医学部解剖学研究所のコア施設で実施されています。共焦点イメージングは、バイオメディカルセンター(BMC)のコア施設であるバイオイメージングで実施されています。著者は、技術的な支援をしてくれた Simone Hofmann、Maria Fischer、Cornelia Herbst、Sabine Fink、Martina Rahmeh に感謝します。
Materials
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
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