Стратегия биобанкирования органоидов рака яичников: решение проблемы межпациентской гетерогенности по гистологическим подтипам и стадиям заболевания
Summary
Этот протокол предлагает систематическую основу для создания органоидов рака яичников на разных стадиях заболевания и решает проблемы вариабельности для конкретного пациента для увеличения выхода и обеспечения надежного долгосрочного расширения для последующего применения. Он включает в себя подробные этапы обработки тканей, посева, корректировки требований к среде и иммунофлуоресцентного окрашивания.
Abstract
В то время как создание биобанка по раку яичников из органоидов, полученных от пациентов, вместе с их клинической информацией обещает прогресс в исследованиях и уходе за пациентами, стандартизация остается проблемой из-за гетерогенности этого смертельного злокачественного новообразования в сочетании со сложностью, присущей органоидной технологии. Этот адаптируемый протокол обеспечивает систематическую основу для реализации всего потенциала органоидов рака яичников с учетом специфической для пациента вариабельности предшественников. Реализуя структурированный экспериментальный рабочий процесс для выбора оптимальных условий культивирования и методов посева, с параллельным тестированием прямого 3D-посева по сравнению с 2D/3D-маршрутом, мы получаем, в большинстве случаев, надежные длительные расширяющиеся линии, подходящие для широкого спектра последующих применений.
Следует отметить, что протокол был протестирован и доказал свою эффективность в большом количестве случаев (N = 120) высокогетерогенного исходного материала, включая высокодифференцированный и низкодифференцированный рак яичников и стадии заболевания с первичным дефолдингом, рецидивирующим заболеванием и постнеоадъювантными хирургическими препаратами. В экзогенной сигнальной среде с низким Wnt и высоким BMP мы наблюдали, что предшественники по-разному восприимчивы к активации Heregulin 1ß (HERß-1)-пути, при этом HERß-1 способствовал образованию органоидов в одних и ингибировал его в других. Для подмножества образцов пациента оптимальное формирование органоидов и долгосрочный рост требуют добавления в среду фактора роста фибробластов 10 и R-спондина 1.
Кроме того, мы выделяем важнейшие этапы расщепления тканей и выделения предшественников, а также указываем на примеры, когда кратковременное культивирование в 2D на пластике полезно для последующего формирования органоидов в матрице Basement Membrane Extract типа 2. В целом, оптимальный биобанкинг требует систематического тестирования всех основных условий параллельно, чтобы определить адекватную среду роста для отдельных линий. Протокол также описывает процедуру обработки для эффективного встраивания, секционирования и окрашивания для получения изображений органоидов с высоким разрешением, что необходимо для комплексного фенотипирования.
Introduction
Клиническое ведение пациенток с эпителиальным раком яичников остается сложной задачей из-за его гетерогенной клинической картины на поздних стадиях ивысокой частоты рецидивов1. Для улучшения нашего понимания развития рака яичников и его биологического поведения необходимы исследовательские подходы, учитывающие специфическую для пациента вариабельность течения заболевания, ответ на лечение, а также гистопатологические и молекулярныеособенности.
Биобанкинг, характеризующийся систематическим сбором и долгосрочным сохранением образцов опухолей, полученных от пациенток с раком яичников, вместе с их клинической информацией, позволяет сохранить большую когорту пациентов на разных стадиях заболевания, включая образцы опухолей после первичных операций по удалению объема, после неоадъювантной химиотерапии и от рецидивирующего заболевания. Она обладает ценным потенциалом для продвижения исследований рака, выступая в качестве ресурса перспективных прогностических биомаркеров и терапевтических мишеней3. Однако традиционные методы биобанкинга, такие как фиксация формалина и замораживание, не поддаются проведению функциональных исследований на исходных образцах опухоли из-за потери жизнеспособности и нарушения нативной трехмерной архитектуры ткани 4,5.
Исследования молекулярных механизмов, как в онкологии, так и за ее пределами, в решающей степени зависят от использования соответствующих экспериментальных моделей, которые точно отражают биологию заболевания и сохраняют свойства in vitro ткани, наблюдаемые in vivo. Органоиды, полученные от пациентов, основанные на сохранении потенциала обновления, воспроизводят в лаборатории первоначальную структуру и функцию эпителия и позволяют проводить тестирование в индивидуальном для пациента контексте. Таким образом, они стали весьма перспективными инструментами для исследования рака и персонализированной медицины, преодолевая разрыв между клиническим разнообразием и лабораторными исследованиями 6,7,8,9. Индивидуальные терапевтические стратегии, основанные на индивидуальных лекарственных реакциях органоидных линий и тестировании функциональной значимости молекулярных профилей, потенциально могут быть непосредственно применены к уходу за пациентами10,11. Возможность долгосрочного культивирования, включая специфические характеристики пациента и сбор соответствующих проспективных клинических данных с течением времени, открывает большие перспективы для выявления новых прогностических и прогностических факторов, участвующих в прогрессировании заболевания и механизмах резистентности 3,9.
Тем не менее, создание биобанка, включающего органоиды из различных образцов опухолей, требует сочетания строгого соблюдения сложной методологии и создания протоколов для легкого обслуживания12. Стандартизация процессов гарантирует, что обученный персонал может эффективно создавать и поддерживать биобанк даже при высокой текучести кадров, в то же время придерживаясь самых высоких стандартов качества13. В нескольких исследованиях сообщалось об успешном создании стабильных органоидных линий рака яичников, соответствующих мутационному и фенотипическому профилю исходной опухоли с различными показателями эффективности. Тем не менее, рутинный биобанкинг остается сложной задачей на практике, особенно для долгосрочного стабильного роста линий, что является предпосылкой для крупномасштабного расширения или успешного редактирования генома.
В частности, вопрос о расширяемости остается расплывчатым в этой области, поскольку органоиды, демонстрирующие медленный и ограниченный потенциал роста, иногда считаются устоявшимися линиями. Как было первоначально продемонстрировано Hoffmann et al., исследованием, основные результаты которого легли в основу этого дальнейшего разработанного протокола, оптимальное обращение с тканью рака яичников требует уникальной стратегии для учета гетерогенности14. Фенотипическая характеристика органоидов, полученных этим методом, и близкое сходство с родительской опухолевой тканью были подтверждены панельным секвенированием ДНК и транскриптомным анализом зрелых культур (4-10 месяцев культивирования), демонстрирующими стабильность модели 8,9,12,14.
В отличие от паракринной среды, которая регулирует гомеостаз в здоровых фаллопиевых трубах, эпителиальный слой, который, вероятно, приводит к высокодифференцированному серозному раку яичников (HGSOC), потенциалу регенерации рака и способности к образованию органоидов, меньше зависит от экзогенных добавок Wnt. Кроме того, активная передача сигналов костного морфогенетического белка (BMP), характеризующаяся отсутствием ноггина в органоидной среде, оказалась полезной для установления долгосрочных культур из отложений твердых тканей рака яичников14,15. В ходе систематического биобанкирования солидных отложений рака яичников мы подтвердили эти результаты и создали конвейер с деталями, изложенными в этом протоколе, который обеспечивает устойчивое долгосрочное расширение в большинстве случаев. Мы обнаружили, что параллельное тестирование различных составов сред и способов посева при работе с первичными изолятами имеет важное значение для улучшения установления долгосрочных стабильных органоидных линий и повышения урожайности, обеспечивая надежное распространение и расширение до многолуночных форматов, необходимых для последующих экспериментов16.
Кроме того, чистота и качество образцов, собранных во время операции, имеют решающее значение для трансляционного потенциала органоидов рака яичников в фундаментальных исследованиях и молекулярной диагностике. Сложность клинической картины HGSOC требует тесного сотрудничества между хирургами, онкологами и учеными в лаборатории, чтобы гарантировать, что соответствующий материал правильно идентифицирован, условия транспортировки поддерживаются постоянными, а органоидные линии генерируются с высокой эффективностью, представляя наиболее важные характеристики заболевания каждого пациента. Этот протокол обеспечивает стандартизированную, но адаптируемую структуру для охвата всего потенциала органоидов рака яичников, учитывая гетерогенность, характерную для рака яичников 16,17. Примечательно, что этот протокол обеспечивает надежное биобанкирование широкого спектра клинической картины рака яичников, включая различные гистологические типы (высокодифференцированный и низкодифференцированный рак яичников, LGSOC), различные отложения от одних и тех же пациенток, которые демонстрируют различия в регуляции стволовой ткани, ткани от операций в пост-неоадъювантных условиях, биопсийный материал и образцы от операций в рецидивирующей фазе прогрессирования заболевания.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разработанный протокол решает ранее поставленные задачи биобанкинга органоидов при раке яичников в отношении органоидообразования и долгосрочного пассажного потенциала, а также обеспечивает генерацию полностью расширяемых линий из большинства солидных опухолевых отложений. Хирур…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование финансируется Немецким центром исследования рака DKTK, партнерским сайтом в Мюнхене, партнерством между DKFZ и университетской клиникой LMU Мюнхена. Исследование также поддержано грантом German Cancer Aid (#70113426 и #70113433). Парафиновое встраивание тканей и органоидов было выполнено на основной установке Института анатомии медицинского факультета Университета Людвига-Максимилиана, Мюнхен. Конфокальная визуализация была проведена в центре Core Bioimaging в Биомедицинском центре (BMC). Авторы выражают благодарность за техническую помощь Симоне Хофманн, Марии Фишер, Корнелии Хербст, Сабине Финк и Мартине Рахме.
Materials
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).
- Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
- Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).
- Coppola, L., et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med. 17 (1), 172 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
- Larsen, B. M., et al. A pan-cancer organoid platform for precision medicine. Cell Rep. 36 (4), 109429 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).
- Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 3 (2), 101407 (2022).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nat Mater. 21 (2), 143-159 (2022).
- Hoffmann, K., et al. Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment. EMBO J. 39 (6), e104013 (2020).
- Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
- Trillsch, F., et al. Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential. STAR Protoc. 4 (3), 102484 (2023).
- Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
- Fuerer, C., Nusse, R. Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway. PLoS One. 5 (2), e9370 (2010).
- . Leica ASP300S – Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1 Available from: https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf (2021)
- Thermo Scientific. . Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual. , (2009).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 10 (1), 12581 (2020).
