Strategi for biobanking av ovariecancer organoider: adressering interpatient heterogenitet på tvers av histologiske subtyper og sykdomsstadier

Summary

Denne protokollen gir et systematisk rammeverk for etablering av organoider for eggstokkreft fra forskjellige sykdomsstadier og adresserer utfordringene med pasientspesifikk variabilitet for å øke utbyttet og muliggjøre robust langsiktig ekspansjon for påfølgende applikasjoner. Den inneholder detaljerte trinn for vevsbehandling, såing, justering av mediekrav og immunfluorescensfarging.

Abstract

Mens etableringen av en biobank for eggstokkreft fra pasientavledede organoider sammen med deres kliniske bakgrunnsinformasjon lover fremskritt innen forskning og pasientbehandling, er standardisering fortsatt en utfordring på grunn av heterogeniteten til denne dødelige maligniteten, kombinert med den iboende kompleksiteten til organoidteknologi. Denne tilpasningsdyktige protokollen gir et systematisk rammeverk for å realisere det fulle potensialet til eggstokkreftorganoider med tanke på en pasientspesifikk variasjon av forfedre. Ved å implementere en strukturert eksperimentell arbeidsflyt for å velge optimale kulturforhold og såingsmetoder, med parallell testing av direkte 3D-såing kontra en 2D/3D-rute, oppnår vi i de fleste tilfeller robuste langsiktige ekspanderende linjer som passer for et bredt spekter av nedstrømsapplikasjoner.

Spesielt har protokollen blitt testet og vist seg effektiv i et stort antall tilfeller (N = 120) av svært heterogent utgangsmateriale, inkludert høygradig og lavgradig eggstokkreft og stadier av sykdommen med primær debulking, tilbakevendende sykdom og post-neoadjuvant kirurgiske prøver. Innenfor et lavt Wnt, høyt BMP-eksogent signalmiljø observerte vi at forfedre var forskjellig utsatt for aktiveringen av Heregulin 1 ß (HERß-1)-banen, med HERß-1 som fremmer organoiddannelse hos noen mens de hemmer den i andre. For en undergruppe av pasientens prøver nødvendiggjør optimal organoiddannelse og langsiktig vekst tilsetning av fibroblastvekstfaktor 10 og R-Spondin 1 til mediet.

Videre fremhever vi de kritiske trinnene i vevsfordøyelse og stamisolering og peker på eksempler der kort dyrking i 2D på plast er gunstig for etterfølgende organoiddannelse i Basement Membrane Extract type 2-matrisen. Samlet sett krever optimal biobanking systematisk testing av alle hovedforhold parallelt for å identifisere et tilstrekkelig vekstmiljø for individuelle linjer. Protokollen beskriver også håndteringsprosedyren for effektiv innebygging, seksjonering og farging for å oppnå høyoppløselige bilder av organoider, noe som kreves for omfattende fenotyping.

Introduction

Klinisk behandling av pasienter med epitelial eggstokkreft er fortsatt utfordrende på grunn av sin heterogene kliniske presentasjon i avanserte stadier og høye tilbakefallsrater¹. Forbedring av vår forståelse av eggstokkreftutvikling og biologisk atferd krever forskningsmetoder som adresserer pasientspesifikk variabilitet i løpet av sykdommen, behandlingsrespons og histopatologiske samt molekylære egenskaper².

Biobanking, karakterisert ved systematisk innsamling og langtidsbevaring av tumorprøver avledet fra eggstokkreftpasienter sammen med deres kliniske informasjon, gir bevaring av en stor pasientkohort i forskjellige sykdomsstadier, inkludert tumorprøver fra primære debulkingoperasjoner, etter neoadjuvant kjemoterapi og fra tilbakevendende sykdom. Det har verdifullt potensial for å fremme kreftforskning, og tjene som en ressurs for lovende prognostiske biomarkører og terapeutiske mål³. Imidlertid er konvensjonelle biobankmetoder, som formalinfiksering og frysing, ikke egnet til å gjennomføre funksjonelle studier på de opprinnelige tumorprøvene på grunn av tap av levedyktighet og forstyrrelsen av den opprinnelige tredimensjonale vevsarkitekturen ^4,5.

Studier av molekylære mekanismer, i onkologi og utover, er avgjørende avhengig av bruk av passende eksperimentelle modeller som trofast reflekterer sykdommens biologi og opprettholder in vitro-egenskapene til vevet observert in vivo. Pasientavledede organoider, basert på bevaring av fornyelsespotensialet, reproduserer i laboratoriet epitelets opprinnelige struktur og funksjon og tillater testing i en pasientspesifikk sammenheng. Derfor har de dukket opp som svært lovende verktøy for kreftforskning og personlig medisin, og bygger bro over gapet mellom klinisk mangfold og laboratorieforskning 6,7,8,9. Skreddersydde terapeutiske strategier basert på individuelle legemiddelresponser av organoide linjer og testing av den funksjonelle relevansen av molekylære profiler, kan potensielt brukes direkte til pasientbehandling^10,11. Muligheten for langtidsdyrking, inkludert pasientspesifikke egenskaper og innsamling av relevante prospektive kliniske data over tid, lover godt å identifisere nye prognostiske og prediktive faktorer involvert i sykdomsprogresjon og resistensmekanismer ^3,9.

Ikke desto mindre krever bygging av en biobank som inkluderer organoider fra forskjellige tumorprøver en kombinasjon av streng overholdelse av kompleks metodikk og oppsett av protokoller for enkelt vedlikehold¹². Prosessstandardisering sikrer at biobanken kan etableres og vedlikeholdes effektivt av utdannet personale selv ved høy omsetning, samtidig som de overholder de høyeste kvalitetsstandarder¹³. Flere studier rapporterte vellykket generering av stabile organoidlinjer for eggstokkreft som tilsvarer den mutasjons- og fenotypiske profilen til den opprinnelige svulsten med varierende effektivitetshastigheter. Likevel er rutinemessig biobank fortsatt utfordrende i praksis, spesielt for langsiktig stabil vekst av linjer, noe som er en forutsetning for storskala utvidelse eller vellykket genomisk redigering.

Spesielt er spørsmålet om utvidelsesmuligheter vagt definert i feltet, da organoider som viser langsomt og begrenset vekstpotensial av og til regnes som etablerte linjer. Som først demonstrert av Hoffmann et al., en studie hvis hovedfunn ga grunnlaget for denne videreutviklede protokollen, krever optimal håndtering av eggstokkreftvev en unik strategi for å imøtekomme heterogenitet¹⁴. Fenotypisk karakterisering av organoider oppnådd ved denne metoden og nær likhet med foreldretumorvev ble bekreftet ved panel-DNA-sekvensering og transkriptomikkanalyse av modne kulturer (4-10 måneders dyrking) som demonstrerte stabiliteten til modellen 8,9,12,14.

I motsetning til det parakrine miljøet som regulerer homeostasen i de sunne egglederne, er epitellaget, som sannsynligvis gir høyverdig serøs eggstokkreft (HGSOC), kreftregenereringspotensial og organoiddannelseskapasitet, mindre avhengig av eksogent Wnt-tilskudd. Videre viste aktiv Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalering, karakterisert ved fravær av Noggin i organoid medium, seg å være gunstig for etablering av langsiktige kulturer fra eggstokkreft faste vevsavsetninger^14,15. Under systematisk biobanking av faste forekomster av eggstokkreft har vi bekreftet disse funnene og satt opp rørledningen, med detaljer skissert i denne protokollen som sikrer vedvarende langsiktig ekspansjon i de fleste tilfeller. Vi finner at parallell testing av forskjellige mediesammensetninger og såmodaliteter ved arbeid med primærisolater er avgjørende for å forbedre etableringen av langsiktige stabile organoidlinjer og for å øke utbyttet som muliggjør robust forplantning og utvidelse til flerbrønnsformater som kreves for nedstrøms eksperimenter¹⁶.

Videre er renheten og kvaliteten på prøvene som samles inn under operasjonen av avgjørende betydning for translasjonspotensialet til eggstokkreftorganoider i grunnforskning og molekylær diagnostikk. Kompleksiteten i den kliniske presentasjonen av HGSOC krever nært samarbeid mellom kirurger, onkologer og forskerne i laboratoriet for å sikre at relevant materiale er korrekt identifisert, transportforholdene holdes konstante og organoidlinjer genereres med høy effektivitet som representerer de viktigste egenskapene til sykdommen til hver pasient. Denne protokollen gir et standardisert, men tilpasningsdyktig rammeverk for å fange det fulle potensialet til eggstokkreftorganoider, med tanke på heterogeniteten som karakteriserer eggstokkreft^16,17. Spesielt muliggjør denne protokollen pålitelig biobanking av det brede spekteret av klinisk presentasjon av eggstokkreft, inkludert forskjellige histologiske typer (høygradig og lavgradig eggstokkreft, LGSOC), forskjellige forekomster fra de samme pasientene som viser forskjeller i stamhetsregulering, vev fra operasjoner i post-neoadjuvant setting, biopsimateriale og prøver fra operasjoner i den tilbakevendende fasen av sykdomsprogresjon.

Protocol

Tumorvevsprøver fra eggstokkreftoperasjoner ble samlet inn og pasientavledede organoider ble generert i samsvar med etikkomiteen ved LMU University (17-471), i samsvar med eksisterende gjeldende EU, nasjonale og lokale forskrifter. Hver pasient som er involvert i studien, har samtykket i skriftlig form. Ved arbeid med ferske vevsprøver kreves Biosafety Level 2 sikkerhetstillatelse og Laminar Flow-skap. Gitt vevsprøvenes potensielt smittsomme karakter, som ikke kan utelukkes på grunn av mangel på rutinemessig testing…

Representative Results

Etter innledende vevsdissosiasjon, filtrering og telling blir celler sådd parallelt direkte i 3D-format, som forklart ovenfor, samt suspensjonen i kolben for kort 2D-utvidelse. I noen tilfeller påvirker den forbigående 2D-ekspansjonen organoiddannelsen positivt, og langtidslinjen er vellykket etablert via denne ruten, mens komparativ parallell 3D-såing kan resultere i vekstarrest (figur 1). For hvert donorvev som behandles, testes cellene i henhold til mediematrisen. Etter denne strategi…

Discussion

Den designede protokollen adresserer tidligere utfordringer med ovariecancer organoid biobanking med hensyn til organoiddannelse og langsiktig passasjepotensial og sikrer generering av fullt utvidbare linjer fra flertallet av faste tumoravsetninger. Den kirurgiske innsamlingsprosessen av tumorprøver som skal brukes til organoidgenerering, påvirker utbyttet og ekspansjonspotensialet betydelig. Tumorvevsprøver kan oppnås under ulike prosedyrer, inkludert multivisceral kirurgi, diagnostisk laparoskopi eller biopsi. Den …

Materials

100 Sterican 26 G	Braun, Melsungen, Germany	4657683
100 Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
293T HA Rspo1-Fc	R&D systems, Minneapolis, USA	3710-001-01	Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)	Merck, Darmstadt, Germany	616454
Advanced DMEM/F-12 Medium	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12634028
Anti-p53 antibody (DO1)	Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA	sc-126
Anti-PAX8 antibody	Proteintech, Manchester, UK	10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µm	Corning, Berlin, Germany	430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	658175
Collagenase I	Thermo Scientific, Waltham, USA	17018029
Costar 48-well Clear TC-treated	Corning, Berlin, Germany	3548
Cryo SFM	PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany	C-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear	R&D systems, Minneapolis, USA	3533-005-02	Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG	Jackson Immuno	715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	C9999-1000ML
DAPI	Thermo Scientific, Waltham, USA	62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel	Thermo Scientific, Waltham, USA	Epredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene	Corning, Berlin, Germany	351447
Feather scalpel	Pfm medical, Cologne, Germany	200130010
Fetal Bovine Serum	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	10270106
Formalin 37% acid free, stabilized	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1019205000
GlutaMAX	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	35050038
HEPES (1 M)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	156630080
Human EpCAM/TROP-1 Antibody	R&D systems, Minneapolis, USA	AF960
Human FGF10	Peprotech, NJ, USA	100-26
Human recombinant BMP2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHC7146
Human recombinant EGF	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1	Peprotech, NJ, USA	100-03
LAS X core Software	Leica Microsystems		https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope	Leica Microsystems
N-2 Supplement (100x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17502-048
Nicotinamide	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	N0636
Omnifix 1 mL	Braun, Melsungen, Germany	3570519
Paraffin
Parafilm	Omnilab, Munich, Germany	5170002
Paraformaldehyd	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1176201000
Pen Strep	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	P4333-100
PluriStrainer 400 µm	PluriSelect, Leipzig, Germany	43-50400-01
Primocin	InvivoGen, Toulouse, France	ant-pm-05
Red Blood Cell Lysing Buffer	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	11814389001
Roticlear	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	A538.5
Surgipath Paraplast	Leica, Wetzlar, Germany	39602012
Thermo Scientific Nunc Cryovials	Thermo Scientific, Waltham, USA	375418PK
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8787
Trypan Blue Stain	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8154
TrypLE Express Enzyme	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12604-013
Tween-20	PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany	A4974-0100
Y-27632	TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany	1254
Zeocin	Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA	R25001