Detta protokoll beskriver hur man genererar mänskliga bukspottkörtelskivor från avlidna organdonatorer för att studera cellfunktion under nästan fysiologiska förhållanden. Detta innovativa tillvägagångssätt gör det möjligt att undersöka normala och strukturellt skadade öar och det intrikata samspelet mellan endokrina och exokrina fack.
Det är viktigt att studera den mänskliga bukspottkörteln för att förstå de patofysiologiska mekanismer som är associerade med typ 1 (T1D) och 2-diabetes (T2D) samt bukspottkörtelns endokrina och exokrina fysiologi och samspel. Mycket har lärts av studiet av isolerade öar i bukspottkörteln, men detta förhindrar att man undersöker deras funktion och interaktioner i ett sammanhang av hela vävnaden. Bukspottkörtelskivor ger en unik möjlighet att utforska fysiologin hos normala, inflammerade och strukturellt skadade öar i deras ursprungliga miljö, vilket i sin tur gör det möjligt att studera interaktioner mellan endokrina och exokrina fack för att bättre undersöka den komplexa dynamiken i bukspottkörtelvävnad. Således representerar antagandet av den levande bukspottkörtelskivplattformen ett betydande framsteg inom området. Detta protokoll beskriver hur man genererar levande vävnadsskivor från avlidna organdonatorer genom vävnadsinbäddning i agaros- och vibratomskivning samt deras användning för att bedöma funktionella avläsningar såsom dynamisk sekretion och avbildning av levande celler.
Studier av ö-rötfysiologi är grundläggande för att förstå patogenesen av diabetes och utveckla nya terapeutiska metoder. Hittills har forskningen förlitat sig på isolerade öar, vilket utsätter öarna för mekaniska och enzymatiska påfrestningar, vilket sannolikt orsakar förändringar i cellfysiologin. Dessutom är det inte möjligt att utvärdera öarnas funktion i samband med deras naturliga vävnadsmiljö, som sannolikt påverkas av bland annat exokrina och vaskulära celler1. När man studerar bukspottkörtel från donatorer med T1D finns det en utmaning att deras öar är svåra att isolera och kan bli fragmenterade under isoleringen, vilket kan ge en selektionseffekt på öar som kanske inte representerar befolkningen in vivo2. Dessutom kommer öar att separeras från sin komplexa miljö och cellulära förbindelser, särskilt från de infiltrerande immuncellerna som finns i inflammerade öar och är vanligare i öarnas periferi. Även om isolerade öar är en hörnsten i diabetesforskningen finns det begränsningar. Som svar på detta introducerar vi ett banbrytande protokoll för att generera levande bukspottkörtelskivor, vilket erbjuder en lösning på dessa utmaningar.
Den senaste utvecklingen och användningen av tekniker för skivning av bukspottkörtelvävnad anses vara ett genombrott för vår förmåga att utforska bukspottkörtelns intrikata biologi och funktioner. Denna innovation har öppnat nya vägar för dynamiska studier av öars fysiologi och interaktioner mellan endokrina, exokrina celler, neurala, vaskulära och immunceller inom deras naturliga anatomiska sammanhang. Till skillnad från konventionella metoder bevarar denna in vitro-inställning mycket av organets cytoarkitektur, vilket möjliggör en närmare approximation till dess ursprungliga biologi. Denna metod, som ursprungligen utvecklades på möss av Speier och Rupnik 20033, har visat sig vara användbar för att bedöma kalciumavbildning, elektrofysiologi och hormonutsöndring för både intra- och intercellulär signalering 4,5,6,7,8,9. Plattformen för bukspottkörtelskivor användes sedan för att studera mänsklig bukspottkörtelvävnad som erhållits via kirurgisk biopsi 4,10,11,12. Vår grupp visade att det är möjligt att erhålla och använda skivor av bukspottkörteln från organdonatorer från kadaver genom verksamheten i nätverket för bukspottkörtelorgandonatorer med diabetes (nPOD)13. nPOD tillhandahåller bukspottkörtelvävnader till godkända forskare som bedriver forskning om mänsklig typ 1-diabetes, och sedan nPOD började använda bukspottkörtelplattformen genererar och distribuerar nPOD rutinmässigt levande bukspottkörtelskivor 14,15,16,17. Sedan implementeringen av plattformen för bukspottkörtelskivor 2020 har nPOD framgångsrikt distribuerat vävnadsskivor från 43 donatorer (inklusive 12 donatorer med T1D) till ett stort antal prövare. Med hjälp av dessa skivor utförde forskare banbrytande forskning om kritiska aspekter av öars funktion och utforskade samspelet mellan öar och kärl, nervsystem och immunceller i samband med T1D 13,18,19,20,21,22,23,24. Många studier har belyst begränsningarna med traditionella metoder och understrukit betydelsen av tekniker som kan fånga det dynamiska samspelet i bukspottkörteln 25,26,27. Anpassningsförmågan hos skivningstekniker från mus till mänsklig bukspottkörtel, i kombination med deras integration i program som Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD), exemplifierar det växande erkännandet av metodens potential att låsa upp värdefulla insikter om sjukdomar som typ 1-diabetes.
Här presenterar vi ett protokoll för att generera livskraftiga vävnadsskivor från bukspottkörteln och deras användning för funktionella avläsningar som dynamisk hormonutsöndring och funktionell avbildning. I likhet med isolering av mänskliga öar påverkas framgången för skivproceduren av olika faktorer, inklusive donatoregenskaper, vävnadssändningstid och vävnadskvalitet25,29. Därför är det viktigt att noggrant välja ut vävnadsprover för experimentet och hålla ischemitiderna till ett minimum. I detta sammanhang bör man noga överväga andra potentiella källor till mänsklig vävnad än likdonatorer. Att inkludera kirurgiska donatorer ger möjlighet att kombinera funktionella slice-data med relevant in vivo-information från samma patient, vilket stärker den translationella relevansen11. Denna vävnadskälla för dock med sig andra faktorer eftersom biopsier vanligtvis kommer från äldre patienter som genomgår pankreatektomi, mestadels på grund av en lokaliserad tumör. Noterbart är att biopsier från bukspottkörteln inte utförs i samband med diabetes.
När du utför själva skivningsproceduren är det viktigt att vävnadsbearbetningen sker i rätt tid. Skivor kan lagras i flera timmar, enligt beskrivningen i detta protokoll, eller odlas under längre perioder, enligt beskrivningen av Qadir et al.19. För närvarande är detta protokoll den enda metoden för att upprätthålla livskraften hos skivorna under längre tid, men framtida insatser bör bedöma funktionella förändringar över olika kulturtider och göra jämförelser med isolerade öar, från samma givare.
Det mest kritiska steget i processen är noggrann vävnadsförberedelse innan inbäddning i agaros. Stora kanaler och fibrotisk vävnad kan komplicera skivningsprocessen och potentiellt leda till att vävnadsblock bryter ut ur agarosen. Om detta inträffar och bitarna förblir rimligt stora kan de bearbetas och bäddas in för skivning. Att upprätthålla god vävnadskvalitet och noggrann bearbetning förbättrar avsevärt skivningsprocedurens effektivitet och ger maximal kvantitet och kvalitet på skivorna. Den tid som förflyter från vävnadsförberedelse till generering av skivor bör inte överstiga 2-3 timmar, eftersom längre intervall avsevärt påverkar vävnadens viabilitet.
Ett enkelt men viktigt steg under perifusion av skivan är den exakta trimningen av skivan för att säkerställa en perfekt passform i kammaren. Detta möjliggör ett korrekt bad av vävnaden och ett oavbrutet flöde. När protokollet väl har initierats är det viktigt att undvika ytterligare manipulation av kamrarna för att förhindra oönskade toppar i hormonfrisättningen. Tillräcklig buffert bör förberedas och slangar bör nå lösningens botten för att förhindra att luft sugs och att kamrarna blir torra.
För kalciumavbildning är det viktigt att välja intresseområde noggrant, beroende på experimentella behov och design. Det är viktigt att minimera fotoblekning genom att välja bildparametrar som minskar ljusexponeringen eller förkortar den totala protokolltiden. Precis som vid utsöndring av dynamiska hormoner är det viktigt att upprätthålla ett korrekt lösningsflöde och en uppvärmd miljö, eftersom skivor kräver nästan fysiologiska förhållanden för optimal funktion (t.ex. 37 °C).
Bukspottkörtelns vävnadsskivor upprätthåller effektivt bukspottkörtelns strukturella integritet och bevarar cell-cell-förbindelser mellan dess olika celltyper. Följaktligen ger de ett alternativ till att arbeta med isolerade öar, vilket underlättar samtidig utforskning av både endokrina och exokrina funktioner och deras samspel. För att kunna bedöma samspelet mellan olika celltyper är det viktigt att skilja mellan dem. Färgning efteråt är ett alternativ, men det har begränsningar när det gäller tillgängliga fluorescerande sonder och utmaningen att lokalisera exakta cellager. Därför är det tillrådligt att införliva cellspecifika stimuli i protokollet för att möjliggöra celldiskriminering baserat på svar. För att skilja mellan celltyper i mus- eller humanskivor inkluderar effektiva stimuli adrenalin för alfaceller21,30, ghrelin för deltaceller31, cerulein för acinärceller 5,32, gallsyror för duktala celler33 och noradrenalin för kärlceller22. Liknande stimuli kan användas för att mäta sekretoriska svar. Medan avbildningsstudier fokuserar på enskilda celler, analyserar sekretionsstudier det kollektiva svaret. Därför är det viktigt att inkludera ett stort antal skivor för att upptäcka de önskade resultaten. Den optimala mängden kan variera mellan olika celltyper, där tre skivor är tillräckliga för endokrina celler. Det är dock tillrådligt att använda fler skivor för att säkerställa detekterbarhet snarare än att riskera att missa värdefull information.
Liksom alla andra metoder har vävnadsskivor begränsningar som man bör ta hänsyn till när man tolkar resultaten. Stimulusapplicering riktad mot specifika celltyper kan leda till effekter på andra celltyper i segmentet, vilket kan utlösa återkopplingsslingor. Men de är också viktiga att studera och därför kan uppmätta responser vara mer representativa för en fysiologisk respons. För selektiv cellmålsökning kan traditionella in vitro-protokoll användas. Det är viktigt att acinärceller innehåller bukspottkörtelenzymer som kan bryta ner proteiner och smälta vävnadsskivan, vilket resulterar i cellulär nedbrytning inom några timmar. För att upprätthålla livskraften är det viktigt att använda trypsinhämmare konsekvent när skivorna befinner sig i ett statiskt tillstånd, även om deras användning kan störa den framgångsrika överföringen av virus som används för märkningsändamål.
Jämfört med öisolering kan donatorvariabilitet och vävnadskvalitet påverka både kvantiteten och livskraften hos de erhållna skivorna. Otillräcklig livskraft efter skivning kan resultera i en kort livslängd och hindra förmågan att odla skivorna. Dessutom kan antalet öar variera avsevärt mellan donatorer, vilket gör det svårt att uppskatta öinnehållet innan experiment utförs. Följaktligen är det avgörande att noggrant välja kriterier för godkännande av donatorer och att implementera lämpliga normaliseringsmetoder, såsom procentandelen hormoninnehåll för utsöndring eller veckningsförändring till baslinjen. För konsekventa resultat rekommenderas det att bedöma vävnadsskivans livsduglighet före experimentet. Dessutom rekommenderas att relevanta kontrollstimuli (t.ex. KCl) införlivas i experimentet. Vid analys av enskilda celler, såsom avbildning, kan försortering av celler baserat på deras svar på dessa kontrollstimuleringar genomföras. Trots de nämnda utmaningarna erbjuder skivorna ett värdefullt komplement till nuvarande forskningsmetoder.
Det beskrivna protokollet kan användas som utgångspunkt för flera tillämpningar, och bukspottkörtelns skivor kan manipuleras och svaren undersökas efter en mängd olika stimuli. Vi hänvisar också läsarna till många forskningsstudier som använder skivor från möss eller mänskliga bukspottkörteln, vilket ger värdefulla insikter för dem som planerar sina experiment. I framtiden är det möjligt att potentiella behandlingar kan undersökas med hjälp av bukspottkörtelskivor eller att sjukdomsmekanismer kan modelleras.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning utfördes med stöd av nätverket för bukspottkörtelorgandonatorer med diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), ett samarbetsprojekt för typ 1-diabetes som stöds av JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) och Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant#2018PG-T1D053, G-2108-04793). Innehållet och åsikterna som uttrycks är författarnas ansvar och återspeglar inte nödvändigtvis den officiella åsikten hos nPOD. Organ Procurement Organizations (OPO) som samarbetar med nPOD för att tillhandahålla forskningsresurser finns listade på http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Författarna är tacksamma mot donatorerna och deras familjer för deras ovärderliga bidrag. Detta arbete stöddes av American Diabetes Association 4-22-PDFPM (J.K.P.) och Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust (anslag 2015-PG-T1D-052).
Alanine | Sigma | A7627 | amino acid |
AlexaFluor 488 goat anti-guineapig | Invitrogen | A11073 | secondary antibody |
AlexaFluor 546 goat anti-rat | Thermo Fisher | A11077 | secondary antibody |
AlexaFluor 647 goat anti-mouse | Thermo Fisher | A21235 | secondary antibody |
Aprotinin | Sigma | A1153 | inhibitor |
Arginine | Sigma | A5006 | amino acid |
Calbryte 520 AM | AAT Bioquest | 20651 | Calcium dye |
Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | Calcium dye |
Fluorescein diacetat | Sigma | F7378 | viability marker |
Glucagon | Sigma | G2654 | primary antibody |
Glucagon ELISA (human kit) | Mercodia | 10-1271-01 | ELISA for hormone detection |
Glutamine | Sigma | G3126 | amino acid |
Insulin | Dako | A-0546 | primary antibody |
Insulin ELISA (human) | Mercodia | 10-1113-01 | ELISA for hormone detection |
Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
LSM 900 | Zeiss | confocal microscope | |
Pancreas Slice Chamber | Biorep Technologies | PERI-PSC-001 | slice chamber for perifucion |
Pancreas Slice Chamber Extender Kit | Biorep Technologies | PERI-PSC-EXT | slice chamber for perifucion |
Pancreas Slice Chamber Perforated Plate | Biorep Technologies | PERI-PSC-PP | slice chamber for perifucion |
Perifusion system with automated tray handling | Biorep Technologies | PERI4-02-230-FA | |
Propidium iodide | Life technologies | P1304MP | dead marker |
Semi-automatic vibratome VT1200S | Leica | 14048142066 | |
Somatostatin | Millipore | MAB354 | primary antibody |