Dissezione, elaborazione istologica e analisi dell'espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino
Summary
In questo articolo, forniamo una procedura pratica per la dissezione e l’esecuzione di analisi istologiche e di espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino.
Abstract
La termogenesi mediata dal tessuto adiposo bruno (BAT) svolge un ruolo importante nella regolazione del metabolismo e la sua morfologia e funzione possono essere notevolmente influenzate dagli stimoli ambientali nei topi e nell’uomo. Attualmente, il BAT interscapolare murino (iBAT), che si trova tra due scapole nel fianco dorsale superiore dei topi, è il principale deposito di BAT utilizzato dai laboratori di ricerca per studiare la funzione dei BAT. Recentemente, sono stati identificati alcuni depositi BAT precedentemente sconosciuti nei topi, tra cui uno analogo al tessuto adiposo bruno sopraclavicolare umano. A differenza dell’iBAT, il tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino (scBAT) si trova nello strato intermedio del collo e quindi non è facilmente accessibile.
Per facilitare lo studio di scBAT murini appena identificati, viene presentato un protocollo che descrive in dettaglio i passaggi per sezionare scBAT intatti da topi postnatali e adulti. A causa delle piccole dimensioni di scBAT rispetto ad altri depositi adiposi, le procedure sono state modificate e ottimizzate specificamente per il trattamento di scBAT. Tra queste modifiche c’è l’uso di un microscopio da dissezione durante la raccolta dei tessuti per aumentare la precisione e l’omogeneizzazione dei campioni scBAT congelati per aumentare l’efficienza della successiva analisi qPCR. Con queste ottimizzazioni, è possibile determinare l’identificazione, l’aspetto morfologico e la caratterizzazione molecolare dello scBAT nei topi.
Introduction
La crescente prevalenza dell’obesità negli Stati Uniti e in tutto il mondo ha suscitato un grande interesse per la comprensione della sua eziologia e l’identificazione di potenziali trattamenti 1,2. Il tessuto adiposo svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo e la disregolazione del tessuto adiposo può portare allo sviluppo dell’obesità. Generalmente, esistono due tipi di tessuto adiposo, il tessuto adiposo bianco e il tessuto adiposo bruno. Mentre il tessuto adiposo bianco (WAT) può immagazzinare energia chimica e secernere fattori endocrini, il tessuto adiposo bruno (BAT) può utilizzare l’energia chimica per generare calore e mantenere la temperatura corporea al freddo 3,4. A causa di questa capacità unica, l’attivazione di BAT può anche aumentare il dispendio energetico e migliorare la sensibilità all’insulina5.
Il BAT esercita la sua funzione attraverso la termogenesi senza brividi, un processo mediato dal disaccoppiamento della proteina 1 (UCP1)6. I mammiferi, compresi i topi e gli esseri umani, possiedono quantità variabili di BAT. La visione classica del BAT è che questi tessuti adiposi sono più abbondanti nei topi e nei neonati che negli esseri umani adulti. iBAT, situato nel fianco dorsale superiore tra le scapole, è il deposito BAT più studiato nei topi. Applicando l’imaging con radioisotopi e i test bioptici, studi recenti hanno identificato diversi depositi di BAT in esseri umani adulti. Alcuni di essi, compresi i depositi trovati nella regione del collo profondo e sopraclavicolare, non erano stati precedentemente identificati nei topi o in altri animali modello 7,8,9,10,11. Tra questi depositi BAT, lo scBAT è il deposito più frequentemente osservato negli esseri umani adulti. Per comprendere meglio l’origine e il contributo molecolare di questi depositi BAT appena scoperti nell’uomo, è essenziale identificare depositi equivalenti nei topi che consentano manipolazioni genetiche e molecolari per tracciare e testare il ruolo funzionale di questi depositi. Pertanto, noi e altri abbiamo identificato alcuni depositi di BAT precedentemente sconosciuti in diverse posizioni anatomiche nei topi, tra cui scBAT12,13, BAT perivascolare toracico 14,15, BAT perirenale16 e BAT periaortico17. Lo scBAT di topo assomiglia anatomicamente allo scBAT umano e morfologicamente assomiglia all’iBAT classico, esprimendo alti livelli di UCP112.
A differenza dell’iBAT di topo, che può essere facilmente sezionato, lo scBAT è situato nello strato intermedio del collo del topo, sotto le ghiandole salivari e lungo la vena giugulare esterna. L’isolamento di questo deposito per le analisi istologiche e molecolari può essere difficile. Qui, descriviamo in dettaglio la procedura per la dissezione di scBAT da topi postnatali e adulti e l’elaborazione di questo deposito per l’analisi istologica e dell’espressione genica.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, presentiamo in dettaglio le procedure per la dissezione e l’elaborazione di scBAT per l’analisi di H&E e di espressione genica. Poiché lo scBAT risiede nello strato intermedio del collo e si trova lungo le grandi vene, l’isolamento di questo deposito richiede una tecnica precisa. In particolare, per ottenere una visione chiara del deposito, si consiglia di posizionare il topo sotto un microscopio da dissezione dopo l’apertura del collo. Utilizzando un paio di pinze a punta superfine per staccare lo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dal NIDDK del NIH con il numero di premio R01DK116899, dall’USDA/ARS con il numero di premio 3092-51000-064-000D e da un premio pilota del Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. I diagrammi di flusso sono stati prodotti utilizzando BioRender.
Materials
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
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