تشريح ، المعالجة النسيجية ، وتحليل التعبير الجيني للأنسجة الدهنية البنية فوق الترقوة
Summary
هنا ، نقدم إجراء عمليا لتشريح وإجراء تحليلات التعبير النسيجي والجيني للأنسجة الدهنية البنية فوق الترقوة.
Abstract
يلعب التوليد الحراري بوساطة الأنسجة الدهنية البنية (BAT) دورا مهما في تنظيم عملية التمثيل الغذائي ، ويمكن أن يتأثر مورفولوجيته ووظيفته بشكل كبير بالمحفزات البيئية في الفئران والبشر. حاليا ، BAT بين كتفي الفئران (iBAT) ، والذي يقع بين اثنين من الكتفين في الجناح الظهري العلوي للفئران ، هو مستودع BAT الرئيسي الذي تستخدمه مختبرات الأبحاث لدراسة وظيفة BAT. في الآونة الأخيرة ، تم تحديد عدد قليل من مستودعات BAT غير المعروفة سابقا في الفئران ، بما في ذلك واحد مشابه للأنسجة الدهنية البنية فوق الترقوة البشرية. على عكس iBAT ، يقع النسيج الدهني البني فوق الترقوة (scBAT) في الطبقة المتوسطة من الرقبة وبالتالي لا يمكن الوصول إليه بسهولة.
لتسهيل دراسة scBAT للفأر الذي تم تحديده حديثا ، يظهر هنا بروتوكول يوضح بالتفصيل خطوات تشريح scBAT سليمة من الفئران بعد الولادة والبالغين. نظرا لصغر حجم scBAT بالنسبة إلى المستودعات الدهنية الأخرى ، فقد تم تعديل الإجراءات وتحسينها خصيصا لمعالجة scBAT. من بين هذه التعديلات استخدام مجهر تشريح أثناء جمع الأنسجة لزيادة دقة وتجانس عينات scBAT المجمدة لرفع كفاءة تحليل qPCR اللاحق. باستخدام هذه التحسينات ، يمكن تحديد المظهر المورفولوجي والتوصيف الجزيئي ل scBAT في الفئران.
Introduction
أثار الانتشار المتزايد للسمنة في الولايات المتحدة وجميع أنحاء العالم اهتماما كبيرا بفهم مسبباتها وتحديد العلاجات المحتملة 1,2. تلعب الأنسجة الدهنية دورا حيويا في عملية التمثيل الغذائي ، ويمكن أن يؤدي عدم تنظيم الأنسجة الدهنية إلى تطور السمنة. بشكل عام ، هناك نوعان من الأنسجة الدهنية ، الأنسجة الدهنية البيضاء والبنية. في حين أن الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) يمكنها تخزين الطاقة الكيميائية وإفراز عوامل الغدد الصماء ، يمكن للأنسجة الدهنية البنية (BAT) استخدام الطاقة الكيميائية لتوليد الحرارة والحفاظ على درجة حرارة الجسم في البرد 3,4. بسبب هذه القدرة الفريدة ، يمكن أن يؤدي تنشيط BAT أيضا إلى زيادة نفقات الطاقة وتحسين حساسية الأنسولين5.
تمارس BAT وظيفتها من خلال توليد الحرارة غير المرتعش ، وهي عملية بوساطة فصل البروتين 1 (UCP1) 6. تمتلك الثدييات ، بما في ذلك الفئران والبشر ، كميات متفاوتة من BAT. وجهة النظر الكلاسيكية ل BAT هي أن هذه الأنسجة الدهنية أكثر وفرة في الفئران والرضع من البشر البالغين. iBAT ، الموجود في الجناح الظهري العلوي بين الكتف ، هو مستودع BAT الأكثر دراسة في الفئران. من خلال تطبيق التصوير بالنظائر المشعة واختبارات الخزعة ، حددت الدراسات الحديثة العديد من مستودعات BAT في البشر البالغين. بعضها ، بما في ذلك المستودعات الموجودة في الرقبة العميقة والمنطقة فوق الترقوة ، لم يتم تحديدها من قبل في الفئران أو غيرها من النموذجية7،8،9،10،11. من بين مستودعات BAT هذه ، يعد scBAT هو المستودع الأكثر شيوعا في البشر البالغين. لفهم الأصل والمساهمة الجزيئية لهذه المستودعات التي تم العثور عليها حديثا في البشر بشكل أفضل ، من الضروري تحديد المستودعات المكافئة في الفئران التي تسمح للتلاعب الجيني والجزيئي بتتبع واختبار الدور الوظيفي لهذه المستودعات. وهكذا ، حددنا نحن وآخرون عددا قليلا من مستودعات BAT غير المعروفة سابقا في مواقع تشريحية مختلفة في الفئران ، بما في ذلك scBAT12,13 ، BAT حول الأوعية الصدرية14,15 ، BAT حول الكلى 16 ، و BAT17 حول الأبهر. يشبه الفأر scBAT تشريحيا scBAT البشري ويشبه شكليا iBAT الكلاسيكي ، معبرا عن مستويات عالية من UCP112.
على عكس iBAT للفأر ، والذي يمكن تشريحه بسهولة ، يقع scBAT في الطبقة المتوسطة من عنق الفأر ، أسفل الغدد اللعابية وعلى طول الوريد الوداجي الخارجي. قد يكون عزل هذا المستودع للتحليلات النسيجية والجزيئية أمرا صعبا. هنا ، نصف بالتفصيل الإجراء الخاص بتشريح scBAT من الفئران بعد الولادة والبالغين ومعالجة هذا المستودع لتحليل الأنسجة والتعبير الجيني.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، نقدم بالتفصيل إجراءات تشريح ومعالجة scBAT لتحليلات H& E والتعبير الجيني. نظرا لأن scBAT موجود في الطبقة المتوسطة من الرقبة ويقع على طول الأوردة الكبيرة ، فإن عزل هذا المستودع يتطلب تقنية دقيقة. على وجه التحديد ، للحصول على رؤية واضحة للمستودع ، نوصي بوضع الماوس تحت مجهر تشريح …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من قبل NIDDK من المعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R01DK116899 ، وزارة الزراعة الأمريكية / ARS تحت رقم الجائزة 3092-51000-064-000D ، وجائزة تجريبية من معهد أبحاث القلب والأوعية الدموية بكلية بايلور للطب. تم إنتاج المخططات الانسيابية باستخدام BioRender.
Materials
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
- Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217 (2022).
- Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
- Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
- Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530 (2021).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166 (2017).
- Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370 (2021).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796 (2017).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).
