Dissektion, histologisk behandling og genekspressionsanalyse af murin supraklavikulært brunt fedtvæv
Summary
Her giver vi en praktisk procedure til dissekering og udførelse af histologiske og genekspressionsanalyser af murin supraklavikulært brunt fedtvæv.
Abstract
Brunt fedtvæv (BAT)-medieret termogenese spiller en vigtig rolle i reguleringen af stofskiftet, og dets morfologi og funktion kan i høj grad påvirkes af miljømæssige stimuli hos mus og mennesker. I øjeblikket er murine interscapular BAT (iBAT), som er placeret mellem to scapulae i musens øvre dorsale flanke, det vigtigste BAT-depot, der anvendes af forskningslaboratorier til at studere BAT-funktion. For nylig blev nogle få tidligere ukendte BAT-depoter identificeret hos mus, herunder et analogt med humant supraklavikulært brunt fedtvæv. I modsætning til iBAT er murin supraklavikulært brunt fedtvæv (scBAT) placeret i det mellemliggende lag af halsen og kan derfor ikke tilgås så let.
For at lette undersøgelsen af nyligt identificeret musescBAT er der heri en protokol, der beskriver trinene til at dissekere intakt scBAT fra postnatale og voksne mus. På grund af scBATs lille størrelse i forhold til andre fedtdepoter er procedurer blevet ændret og optimeret specifikt til behandling af scBAT. Blandt disse modifikationer er brugen af et dissekerende mikroskop under vævsindsamling for at øge præcisionen og homogeniseringen af frosne scBAT-prøver for at øge effektiviteten af efterfølgende qPCR-analyse. Med disse optimeringer kan identifikationen af, morfologisk udseende af og molekylær karakterisering af scBAT bestemmes hos mus.
Introduction
Den stigende forekomst af fedme i USA og på verdensplan har antændt stor interesse for at forstå dets ætiologi og identificere potentielle behandlinger 1,2. Fedtvæv spiller en afgørende rolle i stofskiftet, og dysregulering af fedtvævet kan føre til udvikling af fedme. Generelt er der to typer fedtvæv, hvidt og brunt fedtvæv. Mens hvidt fedtvæv (WAT) kan lagre kemisk energi og udskille endokrine faktorer, kan brunt fedtvæv (BAT) bruge kemisk energi til at generere varme og opretholde kropstemperaturen i kulden 3,4. På grund af denne unikke evne kan aktivering af BAT også øge energiforbruget og forbedre insulinfølsomheden5.
BAT udøver sin funktion gennem ikke-rystende termogenese, en proces medieret af afkobling af protein 1 (UCP1)6. Pattedyr, herunder mus og mennesker, besidder varierende mængder BAT. Den klassiske opfattelse af BAT er, at disse fedtvæv er mere rigelige hos mus og spædbørn end hos voksne mennesker. iBAT, der ligger i den øvre dorsale flanke mellem skulderbladene, er det mest undersøgte BAT-depot hos mus. Ved at anvende radioisotopbilleddannelse og biopsitest identificerede nylige undersøgelser flere BAT-depoter hos voksne mennesker. Nogle af dem, herunder depoterne fundet i den dybe hals og supraklavikulære region, var ikke tidligere blevet identificeret hos mus eller andre modeldyr 7,8,9,10,11. Blandt disse BAT-depoter er scBAT det hyppigst sete depot hos voksne mennesker. For bedre at forstå oprindelsen og det molekylære bidrag fra disse nyfundne BAT-depoter hos mennesker er det vigtigt at identificere ækvivalente depoter i mus, der gør det muligt for genetiske og molekylære manipulationer at spore og teste disse depoters funktionelle rolle. Således identificerede vi og andre nogle få tidligere ukendte BAT-depoter på forskellige anatomiske steder hos mus, herunder scBAT12,13, thorax perivaskulær BAT14,15, perirenal BAT16 og periaorta BAT17. Mus scBAT anatomisk ligner human scBAT og ligner morfologisk klassisk iBAT og udtrykker høje niveauer af UCP112.
I modsætning til musens iBAT, som let kan dissekeres, er scBAT placeret i det mellemliggende lag af musehalsen, under spytkirtlerne og langs den ydre halsvene. Isolering af dette depot til histologiske og molekylære analyser kan være udfordrende. Her beskriver vi detaljeret proceduren for dissekering af scBAT fra postnatale og voksne mus og behandling af dette depot til histologi og genekspressionsanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol præsenterer vi detaljeret procedurerne for dissekering og behandling af scBAT til H&E- og genekspressionsanalyser. Fordi scBAT ligger i det mellemliggende lag af halsen og ligger langs de store vener, kræver isoleringen af dette depot præcis teknik. Specifikt for at få et klart overblik over depotet anbefaler vi at placere musen under et dissekerende mikroskop, efter at halsen er åbnet. Brug af et par superfine punktpincet til at skrælle scBAT af spytkirtlen og de omkringliggende vener, og sørg fo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde understøttes af NIDDK fra NIH under tildelingsnummer R01DK116899, USDA / ARS under tildelingsnummer 3092-51000-064-000D og en pilotpris fra Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. Flowcharts blev produceret ved hjælp af BioRender.
Materials
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
- Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217 (2022).
- Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
- Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
- Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530 (2021).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166 (2017).
- Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370 (2021).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796 (2017).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).
