Dissectie, histologische verwerking en genexpressieanalyse van supraclaviculaire bruine vetweefsel bij muizen
Summary
Hier bieden we een praktische procedure voor het ontleden en uitvoeren van histologische en genexpressie-analyses van supraclaviculair bruin vetweefsel bij muizen.
Abstract
Bruin vetweefsel (BAT)-gemedieerde thermogenese speelt een belangrijke rol bij de regulatie van het metabolisme, en de morfologie en functie ervan kunnen sterk worden beïnvloed door omgevingsstimuli bij muizen en mensen. Momenteel is muizen interscapulaire BAT (iBAT), die zich tussen twee schouderbladen in de bovenste dorsale flank van muizen bevindt, het belangrijkste BAT-depot dat door onderzoekslaboratoria wordt gebruikt om de BAT-functie te bestuderen. Onlangs werden een paar voorheen onbekende BAT-depots geïdentificeerd bij muizen, waaronder een analoog aan menselijk supraclaviculair bruin vetweefsel. In tegenstelling tot iBAT bevindt het supraclaviculaire bruine vetweefsel van muizen (scBAT) zich in de tussenlaag van de nek en is het dus niet zo gemakkelijk toegankelijk.
Om de studie van nieuw geïdentificeerde scBAT bij muizen te vergemakkelijken, wordt hierin een protocol gepresenteerd waarin de stappen worden beschreven om intacte scBAT van postnatale en volwassen muizen te ontleden. Vanwege de kleine omvang van scBAT in vergelijking met andere vetdepots, zijn de procedures aangepast en specifiek geoptimaliseerd voor het verwerken van scBAT. Een van deze wijzigingen is het gebruik van een ontleedmicroscoop tijdens weefselafname om de precisie en homogenisatie van bevroren scBAT-monsters te verhogen om de efficiëntie van de daaropvolgende qPCR-analyse te verhogen. Met deze optimalisaties kan de identificatie van, het morfologische uiterlijk en de moleculaire karakterisering van de scBAT bij muizen worden bepaald.
Introduction
De toenemende prevalentie van obesitas in de VS en wereldwijd heeft grote belangstelling gewekt voor het begrijpen van de etiologie ervan en het identificeren van mogelijke behandelingen 1,2. Vetweefsel speelt een vitale rol in het metabolisme en ontregeling van het vetweefsel kan leiden tot de ontwikkeling van obesitas. Over het algemeen zijn er twee soorten vetweefsel, wit en bruin vetweefsel. Terwijl wit vetweefsel (WAT) chemische energie kan opslaan en endocriene factoren kan afscheiden, kan bruin vetweefsel (BAT) chemische energie gebruiken om warmte op te wekken en de lichaamstemperatuur in de kou op peil te houden 3,4. Vanwege dit unieke vermogen kan activering van BAT ook het energieverbruik verhogen en de insulinegevoeligheidverbeteren5.
BBT oefent zijn functie uit door middel van niet-rillende thermogenese, een proces dat wordt gemedieerd door ontkoppelingseiwit 1 (UCP1)6. Zoogdieren, waaronder muizen en mensen, bezitten verschillende hoeveelheden BBT. De klassieke opvatting van BAT is dat deze vetweefsels overvloediger aanwezig zijn bij muizen en zuigelingen dan bij volwassen mensen. iBAT, gelegen in de bovenste dorsale flank tussen de schouderbladen, is het meest bestudeerde BAT-depot bij muizen. Door radio-isotopenbeeldvorming en biopsietests toe te passen, identificeerden recente studies verschillende BBT-depots bij volwassen mensen. Sommigen van hen, waaronder de depots die in de diepe nek en het supraclaviculaire gebied zijn gevonden, waren niet eerder geïdentificeerd bij muizen of andere modeldieren 7,8,9,10,11. Van deze BAT-depots is de scBAT het meest voorkomende depot bij volwassen mensen. Om de oorsprong en moleculaire bijdrage van deze nieuw gevonden BBT-depots bij mensen beter te begrijpen, is het essentieel om equivalente depots in muizen te identificeren die genetische en moleculaire manipulaties mogelijk maken om de functionele rol van deze depots te traceren en te testen. Zo identificeerden wij en anderen een paar voorheen onbekende BAT-depots op verschillende anatomische locaties bij muizen, waaronder scBAT12,13, thoracale perivasculaire BAT14,15, perirenale BAT16 en periaorta-BAT17. ScBAT van muizen lijkt anatomisch op menselijk scBAT en morfologisch op klassieke iBAT, met hoge niveaus van UCP112.
In tegenstelling tot iBAT bij muizen, dat gemakkelijk kan worden ontleed, bevindt scBAT zich in de tussenlaag van de muizenhals, onder de speekselklieren en langs de uitwendige halsader. Het isoleren van dit depot voor histologische en moleculaire analyses kan een uitdaging zijn. Hier beschrijven we in detail de procedure voor het ontleden van scBAT van postnatale en volwassen muizen en het verwerken van dit depot voor histologie en genexpressie-analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol presenteren we in detail de procedures voor het ontleden en verwerken van scBAT voor H&E- en genexpressie-analyses. Omdat scBAT zich in de tussenlaag van de hals bevindt en langs de grote aders ligt, vereist de isolatie van dit depot een nauwkeurige techniek. Om een duidelijk zicht op het depot te krijgen, raden we aan om de muis na het openen van de hals onder een ontleedmicroscoop te leggen. Met behulp van een superfijne punttang om scBAT van de speekselklier en de omliggende aderen te verwijderen, moet…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door NIDDK van de NIH onder toekenningsnummer R01DK116899, USDA/ARS onder toekenningsnummer 3092-51000-064-000D en een proefprijs van het Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. De stroomschema’s zijn gemaakt met behulp van BioRender.
Materials
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
- Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217 (2022).
- Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
- Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
- Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530 (2021).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166 (2017).
- Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370 (2021).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796 (2017).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).
