Dissektion, histologische Verarbeitung und Genexpressionsanalyse von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe
Summary
Hier bieten wir ein praktisches Verfahren zur Präparierung und Durchführung histologischer und Genexpressionsanalysen von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe.
Abstract
Die durch braunes Fettgewebe (BAT) vermittelte Thermogenese spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des Stoffwechsels, und ihre Morphologie und Funktion kann durch Umweltreize bei Mäusen und Menschen stark beeinflusst werden. Derzeit ist das murine interscapulare BAT (iBAT), das sich zwischen zwei Schulterblättern in der oberen Rückenflanke von Mäusen befindet, das wichtigste BAT-Depot, das von Forschungslabors zur Untersuchung der BAT-Funktion verwendet wird. Kürzlich wurden einige bisher unbekannte BAT-Depots bei Mäusen identifiziert, darunter eines, das dem menschlichen supraklavikulären braunen Fettgewebe entspricht. Im Gegensatz zu iBAT befindet sich das murine supraklavikuläre braune Fettgewebe (scBAT) in der Zwischenschicht des Halses und ist daher nicht so leicht zugänglich.
Um die Untersuchung neu identifizierter Maus-scBAT zu erleichtern, wird hierin ein Protokoll vorgestellt, das die Schritte zur Sezierung von intaktem scBAT von postnatalen und adulten Mäusen detailliert beschreibt. Aufgrund der geringen Größe von scBAT im Vergleich zu anderen Fettdepots wurden die Verfahren speziell für die Verarbeitung von scBAT modifiziert und optimiert. Zu diesen Modifikationen gehört der Einsatz eines Präpariermikroskops während der Gewebeentnahme, um die Präzision und Homogenisierung von gefrorenen scBAT-Proben zu erhöhen, um die Effizienz der nachfolgenden qPCR-Analyse zu erhöhen. Mit diesen Optimierungen können die Identifizierung, das morphologische Auftreten und die molekulare Charakterisierung des scBAT in Mäusen bestimmt werden.
Introduction
Die zunehmende Prävalenz von Fettleibigkeit in den USA und weltweit hat ein großes Interesse am Verständnis ihrer Ätiologie und an der Identifizierung potenzieller Behandlungen geweckt 1,2. Fettgewebe spielt eine wichtige Rolle im Stoffwechsel, und eine Fehlregulation des Fettgewebes kann zur Entwicklung von Fettleibigkeit führen. Im Allgemeinen gibt es zwei Arten von Fettgewebe, weißes und braunes Fettgewebe. Während weißes Fettgewebe (WAT) chemische Energie speichern und endokrine Faktoren absondern kann, kann braunes Fettgewebe (BAT) chemische Energie nutzen, um Wärme zu erzeugen und die Körpertemperatur in der Kälte aufrechtzuerhalten 3,4. Aufgrund dieser einzigartigen Fähigkeit kann die Aktivierung von BAT auch den Energieverbrauch erhöhen und die Insulinsensitivität verbessern5.
BAT übt seine Funktion durch nicht zitternde Thermogenese aus, ein Prozess, der durch die Entkopplung des Proteins 1 (UCP1)6 vermittelt wird. Säugetiere, einschließlich Mäuse und Menschen, besitzen unterschiedliche Mengen an BAT. Die klassische Ansicht von BAT ist, dass diese Fettgewebe bei Mäusen und Säuglingen häufiger vorkommen als bei erwachsenen Menschen. iBAT, das sich in der oberen dorsalen Flanke zwischen den Schulterblättern befindet, ist das am besten untersuchte BAT-Depot bei Mäusen. Durch die Anwendung von Radioisotopenbildgebung und Biopsietests identifizierten neuere Studien mehrere BAT-Depots bei erwachsenen Menschen. Einige von ihnen, einschließlich der Depots im tiefen Hals und im supraklavikulären Bereich, waren zuvor nicht bei Mäusen oder anderen Modelltieren identifiziert worden 7,8,9,10,11. Unter diesen BAT-Depots ist das scBAT das am häufigsten gesehene Depot bei erwachsenen Menschen. Um den Ursprung und den molekularen Beitrag dieser neu entdeckten BAT-Depots beim Menschen besser zu verstehen, ist es wichtig, äquivalente Depots in Mäusen zu identifizieren, die genetische und molekulare Manipulationen ermöglichen, um die funktionelle Rolle dieser Depots zu verfolgen und zu testen. Daher identifizierten wir und andere einige bisher unbekannte BAT-Depots an verschiedenen anatomischen Stellen bei Mäusen, darunter scBAT12,13, thorakale perivaskuläre BAT14,15, perirenale BAT16 und periaortale BAT17. Maus-scBAT ähnelt anatomisch dem menschlichen scBAT und ähnelt morphologisch dem klassischen iBAT, wobei es hohe Konzentrationen von UCP112 exprimiert.
Im Gegensatz zu Maus-iBAT, das leicht präpariert werden kann, befindet sich scBAT in der Zwischenschicht des Maushalses, unter den Speicheldrüsen und entlang der äußeren Halsvene. Die Isolierung dieses Depots für histologische und molekulare Analysen kann eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir detailliert das Verfahren zur Dissektion von scBAT aus postnatalen und adulten Mäusen und zur Verarbeitung dieses Depots für die Histologie und Genexpressionsanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll stellen wir die Verfahren zur Dissektion und Verarbeitung von scBAT für H&E- und Genexpressionsanalysen detailliert vor. Da sich scBAT in der Zwischenschicht des Halses befindet und entlang der großen Venen liegt, erfordert die Isolierung dieses Depots eine präzise Technik. Um eine klare Sicht auf das Depot zu erhalten, empfehlen wir, die Maus nach dem Öffnen des Halses unter ein Präpariermikroskop zu legen. Verwenden Sie eine superfeine Pinzette, um scBAT von der Speicheldrüse und den umgebende…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird vom NIDDK des NIH unter der Fördernummer R01DK116899, USDA/ARS unter der Fördernummer 3092-51000-064-000D und einem Pilotpreis des Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute unterstützt. Die Flussdiagramme wurden mit BioRender erstellt.
Materials
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
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