यहां, हम murine supraclavicular brown वसा ऊतक के हिस्टोलॉजिकल और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण को विदारक और प्रदर्शन करने के लिए एक व्यावहारिक प्रक्रिया प्रदान करते हैं।
ब्राउन वसा ऊतक (बीएटी) -मध्यस्थता थर्मोजेनेसिस चयापचय के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और इसकी आकृति विज्ञान और कार्य चूहों और मनुष्यों में पर्यावरणीय उत्तेजनाओं से बहुत प्रभावित हो सकता है। वर्तमान में, murine interscapular BAT (iBAT), जो चूहों के ऊपरी पृष्ठीय फ्लैंक में दो स्कैपुला के बीच स्थित है, BAT फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए अनुसंधान प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया जाने वाला मुख्य BAT डिपो है। हाल ही में, चूहों में कुछ पहले अज्ञात बैट डिपो की पहचान की गई थी, जिसमें मानव सुप्राक्लेविकुलर ब्राउन वसा ऊतक के अनुरूप एक भी शामिल था। आईबीएटी के विपरीत, म्यूरिन सुप्राक्लेविकुलर ब्राउन एडिपोज टिश्यू (एससीबीएटी) गर्दन की मध्यवर्ती परत में स्थित होता है और इस प्रकार इसे आसानी से एक्सेस नहीं किया जा सकता है।
नए पहचाने गए माउस स्कैट के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए, यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जो प्रसवोत्तर और वयस्क चूहों से बरकरार एससीबीएटी को विच्छेदन करने के चरणों का विवरण देता है। अन्य वसा डिपो के सापेक्ष scBAT के छोटे आकार के कारण, प्रक्रियाओं को विशेष रूप से scBAT प्रसंस्करण के लिए संशोधित और अनुकूलित किया गया है। इन संशोधनों के बीच ऊतक संग्रह के दौरान एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए जमे हुए scBAT नमूनों की सटीकता और homogenization बढ़ाने के लिए बाद qPCR विश्लेषण की दक्षता बढ़ाने के लिए है. इन अनुकूलन के साथ, की पहचान, रूपात्मक उपस्थिति, और scBAT के आणविक लक्षण वर्णन चूहों में निर्धारित किया जा सकता है.
अमेरिका और दुनिया भर में मोटापे की बढ़ती व्यापकता अपने एटियलजि को समझने और संभावित उपचार 1,2 की पहचान करने में बहुत रुचि प्रज्वलित किया है. वसा ऊतक चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और वसा ऊतक के विकृति से मोटापे का विकास हो सकता है। आम तौर पर, दो प्रकार के वसा ऊतक, सफेद और भूरे रंग के वसा ऊतक होते हैं। जबकि सफेद वसा ऊतक (वाट) रासायनिक ऊर्जा स्टोर और अंतःस्रावी कारकों का स्राव कर सकते हैं, ब्राउन वसा ऊतक (बैट) गर्मी उत्पन्न करने और ठंड 3,4 में शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए रासायनिक ऊर्जा का उपयोग कर सकते हैं. इस अनूठी क्षमता के कारण, बैट की सक्रियता भी ऊर्जा व्यय में वृद्धि कर सकती है और इंसुलिन संवेदनशीलता में सुधार कर सकतीहै।
बैट गैर-कंपकंपी थर्मोजेनेसिस के माध्यम से अपने कार्य को पूरा करता है, प्रोटीन 1 (यूसीपी 1) 6 को अनकपलिंग द्वारा मध्यस्थता की गई प्रक्रिया। चूहों और मनुष्यों सहित स्तनधारियों के पास बैट की अलग-अलग मात्रा होती है। बैट का शास्त्रीय दृष्टिकोण यह है कि ये वसा ऊतक वयस्क मनुष्यों की तुलना में चूहों और शिशुओं में अधिक प्रचुर मात्रा में हैं। iBAT, स्कैपुला के बीच ऊपरी पृष्ठीय फ्लैंक में स्थित है, चूहों में सबसे अधिक अध्ययन किया गया बैट डिपो है। रेडियोसोटोप इमेजिंग और बायोप्सी परीक्षणों को लागू करके, हाल के अध्ययनों ने वयस्क मनुष्यों में कई बैट डिपो की पहचान की। उनमें से कुछ, गहरी गर्दन और supraclavicular क्षेत्र में पाया डिपो सहित, पहले चूहों या अन्य मॉडल जानवरों 7,8,9,10,11 में पहचान नहीं की गई थी. इन बैट डिपो में, scBAT वयस्क मनुष्यों में सबसे अधिक बार देखा जाने वाला डिपो है। मनुष्यों में इन नए पाए गए बैट डिपो की उत्पत्ति और आणविक योगदान को बेहतर ढंग से समझने के लिए, चूहों में समकक्ष डिपो की पहचान करना आवश्यक है जो आनुवंशिक और आणविक जोड़तोड़ को इन डिपो की कार्यात्मक भूमिका का पता लगाने और परीक्षण करने की अनुमति देते हैं। इस प्रकार, हम और दूसरों ने चूहों में विभिन्न शारीरिक स्थानों में कुछ पहले अज्ञात बैट डिपो की पहचान की, जिसमें एससीबीएटी12,13, थोरैसिक पेरिवास्कुलर बैट 14,15, पेरिरेनल बैट16, और पेरियाओर्टिक बैट17 शामिल हैं। माउस scBAT शारीरिक रूप से मानव scBAT जैसा दिखता है और रूपात्मक रूप से शास्त्रीय iBAT जैसा दिखता है, UCP112 के उच्च स्तर को व्यक्त करता है।
माउस iBAT के विपरीत, जिसे आसानी से विच्छेदित किया जा सकता है, scBAT माउस गर्दन की मध्यवर्ती परत में, लार ग्रंथियों के नीचे और बाहरी जुगुलर नस के साथ स्थित है। हिस्टोलॉजिकल और आणविक विश्लेषण के लिए इस डिपो का अलगाव चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यहां, हम प्रसवोत्तर और वयस्क चूहों से scBAT को विदारक करने और ऊतक विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इस डिपो को संसाधित करने की प्रक्रिया का विस्तार से वर्णन करते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, हम एच एंड ई और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए scBAT विदारक और प्रसंस्करण के लिए प्रक्रियाओं में विस्तार से प्रस्तुत करते हैं। क्योंकि scBAT गर्दन की मध्यवर्ती परत में रहता है और बड़ी नसों के…
The authors have nothing to disclose.
यह काम एनआईएच के एनआईडीडीके द्वारा अवार्ड नंबर R01DK116899, यूएसडीए/एआरएस अवार्ड नंबर 3092-51000-064-000D के तहत और बायलर कॉलेज ऑफ मेडिसिन कार्डियोवास्कुलर रिसर्च इंस्टीट्यूट से एक पायलट अवार्ड द्वारा समर्थित है। बायोरेंडर का उपयोग करके फ़्लोचार्ट का उत्पादन किया गया था।
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
RNase H | NEB | M0297S | |
Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |