Her gir vi en praktisk prosedyre for dissekering og utførelse av histologiske og genuttrykksanalyser av murine supraklavikulært brunt fettvev.
Brunt fettvev (BAT)-mediert termogenese spiller en viktig rolle i reguleringen av metabolisme, og dens morfologi og funksjon kan i stor grad påvirkes av miljøstimuli hos mus og mennesker. For tiden er murine interscapular BAT (iBAT), som ligger mellom to scapulae i den øvre dorsale flanken av mus, det viktigste BAT-depotet som brukes av forskningslaboratorier for å studere BAT-funksjonen. Nylig ble noen tidligere ukjente BAT-depoter identifisert hos mus, inkludert en analog med humant supraklavikulært brunt fettvev. I motsetning til iBAT ligger murine supraklavikulært brunt fettvev (scBAT) i det mellomliggende laget av nakken og kan derfor ikke nås like lett.
For å lette studiet av nylig identifisert mus scBAT, presenteres her er en protokoll som beskriver trinnene for å dissekere intakt scBAT fra postnatale og voksne mus. På grunn av scBATs lille størrelse i forhold til andre fettdepoter, har prosedyrene blitt modifisert og optimalisert spesielt for behandling av scBAT. Blant disse modifikasjonene er bruken av et dissekerende mikroskop under vevsinnsamling for å øke presisjonen og homogeniseringen av frosne scBAT-prøver for å øke effektiviteten av påfølgende qPCR-analyse. Med disse optimaliseringene kan identifisering av, morfologisk utseende av og molekylær karakterisering av scBAT bestemmes hos mus.
Den økende forekomsten av fedme i USA og over hele verden har antent stor interesse for å forstå sin etiologi og identifisere potensielle behandlinger 1,2. Fettvev spiller en viktig rolle i stoffskiftet, og dysregulering av fettvevet kan føre til utvikling av fedme. Vanligvis er det to typer fettvev, hvitt og brunt fettvev. Mens hvitt fettvev (WAT) kan lagre kjemisk energi og utskille endokrine faktorer, kan brunt fettvev (BAT) bruke kjemisk energi til å generere varme og opprettholde kroppstemperaturen i kulde 3,4. På grunn av denne unike evnen kan aktivering av BAT også øke energiforbruket og forbedre insulinfølsomheten5.
BAT utøver sin funksjon gjennom ikke-rystende termogenese, en prosess mediert av frakobling av protein 1 (UCP1)6. Pattedyr, inkludert mus og mennesker, har varierende mengder BAT. Det klassiske synet på BAT er at disse fettvevene er mer rikelig hos mus og spedbarn enn hos voksne mennesker. iBAT, som ligger i den øvre dorsale flanken mellom scapulae, er det mest studerte BAT-depotet hos mus. Ved å bruke radioisotopavbildning og biopsitester, identifiserte nyere studier flere BAT-depoter hos voksne mennesker. Noen av dem, inkludert depotene som ble funnet i den dype halsen og supraklavikulære regionen, hadde ikke tidligere blitt identifisert hos mus eller andre modelldyr 7,8,9,10,11. Blant disse BAT-depotene er scBAT det hyppigst sette depotet hos voksne mennesker. For bedre å forstå opprinnelsen og det molekylære bidraget til disse nylig oppdagede BAT-depotene hos mennesker, er det viktig å identifisere ekvivalente depoter hos mus som tillater genetiske og molekylære manipulasjoner å spore og teste den funksjonelle rollen til disse depotene. Dermed identifiserte vi og andre noen tidligere ukjente BAT-depoter på forskjellige anatomiske steder hos mus, inkludert scBAT12,13, thorax perivaskulær BAT14,15, perirenal BAT16 og periaortisk BAT17. Mus scBAT ligner anatomisk menneskelig scBAT og morfologisk ligner klassisk iBAT, og uttrykker høye nivåer av UCP112.
I motsetning til mus iBAT, som lett kan dissekeres, ligger scBAT i det mellomliggende laget av musehalsen, under spyttkjertlene og langs den ytre vena jugularis. Isolering av dette depotet for histologiske og molekylære analyser kan være utfordrende. Her beskriver vi i detalj prosedyren for dissekering av scBAT fra postnatale og voksne mus og behandling av dette depotet for histologi og genuttrykksanalyse.
I denne protokollen presenterer vi i detalj prosedyrene for dissekering og behandling av scBAT for H&E og genuttrykksanalyser. Fordi scBAT ligger i det mellomliggende laget av nakken og ligger langs de store venene, krever isolasjonen av dette depotet presis teknikk. Spesielt, for å få et klart syn på depotet, anbefaler vi å plassere musen under et dissekerende mikroskop etter at nakken er åpnet. Ved å bruke en superfin punkttang for å skrelle scBAT av spyttkjertelen og omkringliggende vener, bør det utvises fors…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av NIDDK fra NIH under Award Number R01DK116899, USDA / ARS under Award Number 3092-51000-064-000D, og en pilotpris fra Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. Flytskjemaene ble produsert ved hjelp av BioRender.
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
RNase H | NEB | M0297S | |
Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |