Summary

Disseksjon, histologisk prosessering og genekspresjonsanalyse av murine supraklavikulært brunt fettvev

Published: March 29, 2024
doi:

Summary

Her gir vi en praktisk prosedyre for dissekering og utførelse av histologiske og genuttrykksanalyser av murine supraklavikulært brunt fettvev.

Abstract

Brunt fettvev (BAT)-mediert termogenese spiller en viktig rolle i reguleringen av metabolisme, og dens morfologi og funksjon kan i stor grad påvirkes av miljøstimuli hos mus og mennesker. For tiden er murine interscapular BAT (iBAT), som ligger mellom to scapulae i den øvre dorsale flanken av mus, det viktigste BAT-depotet som brukes av forskningslaboratorier for å studere BAT-funksjonen. Nylig ble noen tidligere ukjente BAT-depoter identifisert hos mus, inkludert en analog med humant supraklavikulært brunt fettvev. I motsetning til iBAT ligger murine supraklavikulært brunt fettvev (scBAT) i det mellomliggende laget av nakken og kan derfor ikke nås like lett.

For å lette studiet av nylig identifisert mus scBAT, presenteres her er en protokoll som beskriver trinnene for å dissekere intakt scBAT fra postnatale og voksne mus. På grunn av scBATs lille størrelse i forhold til andre fettdepoter, har prosedyrene blitt modifisert og optimalisert spesielt for behandling av scBAT. Blant disse modifikasjonene er bruken av et dissekerende mikroskop under vevsinnsamling for å øke presisjonen og homogeniseringen av frosne scBAT-prøver for å øke effektiviteten av påfølgende qPCR-analyse. Med disse optimaliseringene kan identifisering av, morfologisk utseende av og molekylær karakterisering av scBAT bestemmes hos mus.

Introduction

Den økende forekomsten av fedme i USA og over hele verden har antent stor interesse for å forstå sin etiologi og identifisere potensielle behandlinger 1,2. Fettvev spiller en viktig rolle i stoffskiftet, og dysregulering av fettvevet kan føre til utvikling av fedme. Vanligvis er det to typer fettvev, hvitt og brunt fettvev. Mens hvitt fettvev (WAT) kan lagre kjemisk energi og utskille endokrine faktorer, kan brunt fettvev (BAT) bruke kjemisk energi til å generere varme og opprettholde kroppstemperaturen i kulde 3,4. På grunn av denne unike evnen kan aktivering av BAT også øke energiforbruket og forbedre insulinfølsomheten5.

BAT utøver sin funksjon gjennom ikke-rystende termogenese, en prosess mediert av frakobling av protein 1 (UCP1)6. Pattedyr, inkludert mus og mennesker, har varierende mengder BAT. Det klassiske synet på BAT er at disse fettvevene er mer rikelig hos mus og spedbarn enn hos voksne mennesker. iBAT, som ligger i den øvre dorsale flanken mellom scapulae, er det mest studerte BAT-depotet hos mus. Ved å bruke radioisotopavbildning og biopsitester, identifiserte nyere studier flere BAT-depoter hos voksne mennesker. Noen av dem, inkludert depotene som ble funnet i den dype halsen og supraklavikulære regionen, hadde ikke tidligere blitt identifisert hos mus eller andre modelldyr 7,8,9,10,11. Blant disse BAT-depotene er scBAT det hyppigst sette depotet hos voksne mennesker. For bedre å forstå opprinnelsen og det molekylære bidraget til disse nylig oppdagede BAT-depotene hos mennesker, er det viktig å identifisere ekvivalente depoter hos mus som tillater genetiske og molekylære manipulasjoner å spore og teste den funksjonelle rollen til disse depotene. Dermed identifiserte vi og andre noen tidligere ukjente BAT-depoter på forskjellige anatomiske steder hos mus, inkludert scBAT12,13, thorax perivaskulær BAT14,15, perirenal BAT16 og periaortisk BAT17. Mus scBAT ligner anatomisk menneskelig scBAT og morfologisk ligner klassisk iBAT, og uttrykker høye nivåer av UCP112.

I motsetning til mus iBAT, som lett kan dissekeres, ligger scBAT i det mellomliggende laget av musehalsen, under spyttkjertlene og langs den ytre vena jugularis. Isolering av dette depotet for histologiske og molekylære analyser kan være utfordrende. Her beskriver vi i detalj prosedyren for dissekering av scBAT fra postnatale og voksne mus og behandling av dette depotet for histologi og genuttrykksanalyse.

Protocol

Dyreprosedyrene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Baylor College of Medicine. Alle prosedyrene ble utført på C57BL/6J hannmus i alderen 3 uker og 3 måneder gamle. Før disseksjonen ble alle mus avlivet ved hjelp av den godkjente avlivningsprosedyren for karbondioksid fra gnagere. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og instrumenter som brukes i denne protokollen. 1. Disseksjon av scBAT Plasser m…

Representative Results

I motsetning til iBAT, som ligger i det subkutane laget av ryggen mellom to scapulae, ligger scBAT i det mellomliggende laget av nakken, og strekker seg dypt mellom lag av skjelettmuskulatur og spyttkjertelen når den vokser langs den ytre halsvenen (figur 1A). Dissekering scBAT er ikke så grei som iBAT. Her gir vi en detaljert prosedyre inkludert viktige trinn for å dissekere intakt scBAT fra postnatale og voksne mus (figur 1B,C</stron…

Discussion

I denne protokollen presenterer vi i detalj prosedyrene for dissekering og behandling av scBAT for H&E og genuttrykksanalyser. Fordi scBAT ligger i det mellomliggende laget av nakken og ligger langs de store venene, krever isolasjonen av dette depotet presis teknikk. Spesielt, for å få et klart syn på depotet, anbefaler vi å plassere musen under et dissekerende mikroskop etter at nakken er åpnet. Ved å bruke en superfin punkttang for å skrelle scBAT av spyttkjertelen og omkringliggende vener, bør det utvises fors…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet støttes av NIDDK fra NIH under Award Number R01DK116899, USDA / ARS under Award Number 3092-51000-064-000D, og en pilotpris fra Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. Flytskjemaene ble produsert ved hjelp av BioRender.

Materials

95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) Epredia 8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) Epredia 8101
96-well PCR plate Bio-Rad MLL9601
Aurum Binding Mini Column Bio-Rad 7326826
Aurum High Stringency Wash Bio-Rad 7326803
Aurum Low Stringency Wash Bio-Rad 7326804
Base Molds (for embedding) Tissue-Tek 4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" Becton Dickinson 305167
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL Fisherbrand 02-681-453
Centrifuge  Eppendorf 5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument Bio-Rad 12011319
Chloroform Thermo Scientific Chemicals 383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium Epredia 83104
DEPC-Treated Water Ambion AM 9906
Dissecting Microscope Nikon SMZ1500
DNase Dilution Solution Bio-Rad 7326805
DNase I Bio-Rad 7326828
dNTPs Invitrogen 18427013
Elution solution Bio-Rad 7326801
EM 400 embedding medium paraffin Leica Biosystems 3801320
Eosin Y (0.5% w/v) RICCA 2858-16
Formula R Infiltration medium paraffin Leica Biosystems 3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349 Bio Express S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin Sigma-Aldrich GHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol) Fisher Chemical A142212
IP VI Embedding Cassettes Leica Biosystems 39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) Decon Labs V1001
MgCl2 (25 mM) Thermo Fisher Scientific R0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL Avantor 87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals) Bio-Rad MSB1001
Microtome Leica Biosystems RM2245
Molecular Biology Grade Water Corning 46-000-CM
Mortar Coors Tek Thomas Scientific 60310
NaCl (for 0.85% saline) Fisher Bioreagents BP358-212
NanoDrop Spectrophotometer NanoDrop Technologies ND-1000 UV/Vis
Oligo dT Invitrogen 18418020
Paraffin Section Flotation Bath Boekel Scientific 14792V
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148-500G
PCR Tube Strip Avantor 76318-802
Pestle by Coors Tek Thomas Scientific 60311
Pestle Pellet Motor Kimble 749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven  Thermo Fisher Scientific CAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM
5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’
Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM
5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM
5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM
5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM
5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM
5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’
Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM
5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’
Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM
5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM
5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM
5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM
5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM
5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’
Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol) Bio-Rad 7326880
RNase Away (surface decontaminant) Thermo Scientific 1437535
RNase H NEB M0297S
Rnase inhibitor (RNase Out) Invitrogen 10777019
Scintillation Vial (glass) Electron Microscopy Sciences 72632
Slide drying bench  Electrothermal (Cole-Parmer) MH6616
Stainless staining rack Electron Microscopy Sciences 70312-54
Stereo microscope (for embedding) Olympus SZ51
Sugical scissors McKesson 43-1-104
Superfine point Straight Dissecting Forceps Avantor 82027-402
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT)  Invitrogen 18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL Terumo 100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) Applied Biosystems A25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) Electron Microscopy Sciences SKU: 62540-01
Toluene Fisher Chemical T324-1
Transfer pipette Avantor 414004-005
Xylene Fisher Chemical X3P-1GAL

References

  1. Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217 (2022).
  2. Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
  3. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  4. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
  5. Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530 (2021).
  6. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  7. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  8. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  9. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  10. Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
  11. Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
  12. Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166 (2017).
  13. Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370 (2021).
  14. Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
  15. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
  16. de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
  17. Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
  18. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796 (2017).
  19. Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).
check_url/fr/66475?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Waterstraat, M. G., Wang, Z., Kogiso, M., Caballero-Juarez, R., Chen, M. Dissection, Histological Processing, and Gene Expression Analysis of Murine Supraclavicular Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (205), e66475, doi:10.3791/66475 (2024).

View Video