Dissecção, processamento histológico e análise da expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino
Summary
Aqui, fornecemos um procedimento prático para dissecar e realizar análises histológicas e de expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino.
Abstract
A termogênese mediada pelo tecido adiposo marrom (BAT) desempenha um papel importante na regulação do metabolismo, e sua morfologia e função podem ser grandemente impactadas por estímulos ambientais em camundongos e humanos. Atualmente, a MTD interescapular murina (BATi), localizada entre duas escápulas no flanco dorsal superior de camundongos, é o principal depósito de MTD utilizado pelos laboratórios de pesquisa para estudar a função das MTD. Recentemente, alguns depósitos de MTD previamente desconhecidos foram identificados em camundongos, incluindo um análogo ao tecido adiposo marrom supraclavicular humano. Ao contrário do iBAT, o tecido adiposo marrom supraclavicular murino (scBAT) está situado na camada intermediária do pescoço e, portanto, não pode ser acessado tão facilmente.
Para facilitar o estudo de scBAT de camundongos recém-identificados, é apresentado aqui um protocolo detalhando os passos para dissecar scBAT intacta de camundongos pós-natais e adultos. Devido ao pequeno tamanho do scBAT em relação a outros depósitos adiposos, os procedimentos foram modificados e otimizados especificamente para o processamento do scBAT. Entre essas modificações está o uso de um microscópio dissecante durante a coleta de tecidos para aumentar a precisão e homogeneização de amostras de scBAT congeladas para aumentar a eficiência da análise subsequente de qPCR. Com essas otimizações, a identificação, a aparência morfológica e a caracterização molecular da scBAT podem ser determinadas em camundongos.
Introduction
O aumento da prevalência da obesidade nos EUA e no mundo tem despertado grande interesse na compreensão de sua etiologia e na identificação de potenciais tratamentos 1,2. O tecido adiposo desempenha um papel vital no metabolismo, e a desregulação do tecido adiposo pode levar ao desenvolvimento da obesidade. Geralmente, existem dois tipos de tecido adiposo, tecido adiposo branco e marrom. Enquanto o tecido adiposo branco (TAB) pode armazenar energia química e secretar fatores endócrinos, o tecido adiposo marrom (BAT) pode utilizar energia química para gerar calor e manter a temperatura corporal no frio 3,4. Devido a essa habilidade única, a ativação da MTD também pode aumentar o gasto energético e melhorar a sensibilidade à insulina5.
A MTD exerce sua função através da termogênese sem tremores, um processo mediado pela proteína desacopladora 1 (UCP1)6. Mamíferos, incluindo camundongos e humanos, possuem quantidades variáveis de BAT. A visão clássica da MTD é que esses tecidos adiposos são mais abundantes em camundongos e lactentes do que em humanos adultos. O iBAT, localizado no flanco dorsal superior entre as escápulas, é o depósito de MTD mais estudado em camundongos. Através da aplicação de exames de imagem com radioisótopos e biópsias, estudos recentes identificaram vários depósitos de MTD em humanos adultos. Alguns deles, incluindo os depósitos encontrados no pescoço profundo e região supraclavicular, não haviam sido previamente identificados em camundongos ou outros animais modelo7,8,9,10,11. Entre esses depósitos BAT, o scBAT é o depósito mais frequentemente visto em humanos adultos. Para entender melhor a origem e a contribuição molecular desses depósitos BAT recém-encontrados em humanos, é essencial identificar depósitos equivalentes em camundongos que permitam manipulações genéticas e moleculares para rastrear e testar o papel funcional desses depósitos. Assim, nós e outros identificamos alguns depósitos de MTD previamente desconhecidos em diferentes localizações anatômicas em camundongos, incluindo MTD scBAT12,13, BAT perivascular torácica 14,15, BAT perirrenal16 e BAT periaórtica17. O scBAT de camundongo se assemelha anatomicamente ao scBAT humano e morfologicamente se assemelha ao iBAT clássico, expressando altos níveis de UCP112.
Ao contrário do iBAT de camundongo, que pode ser facilmente dissecado, o scBAT está situado na camada intermediária do pescoço de camundongos, abaixo das glândulas salivares e ao longo da veia jugular externa. O isolamento deste depósito para análises histológicas e moleculares pode ser um desafio. Aqui, descrevemos em detalhes o procedimento para dissecar scBAT de camundongos pós-natais e adultos e processar este depósito para histologia e análise de expressão gênica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, apresentamos em detalhes os procedimentos de dissecação e processamento de scBAT para análises de H&E e expressão gênica. Como o scBAT reside na camada intermediária do pescoço e fica ao longo das grandes veias, o isolamento desse depósito requer técnica precisa. Especificamente, para obter uma visão clara do depósito, recomendamos colocar o camundongo sob um microscópio dissecante após a abertura do pescoço. Usando um par de pinças de ponto superfino para descascar a glândula salivar e a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo NIDDK do NIH sob o número de prêmio R01DK116899, USDA/ARS sob o número de prêmio 3092-51000-064-000D, e um prêmio piloto do Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. Os fluxogramas foram produzidos utilizando o BioRender.
Materials
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
- Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217 (2022).
- Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
- Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
- Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530 (2021).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166 (2017).
- Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370 (2021).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796 (2017).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).
