Ici, nous fournissons une procédure pratique pour disséquer et effectuer des analyses histologiques et d’expression génique du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin.
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Article de méthode
Dissection, traitement histologique et analyse de l’expression génique du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin
Dans cet article
Résumé
Résumé
La thermogenèse médiée par le tissu adipeux brun (MTD) joue un rôle important dans la régulation du métabolisme, et sa morphologie et sa fonction peuvent être grandement influencées par les stimuli environnementaux chez la souris et l’homme. Actuellement, la MTD interscapulaire murine (iBAT), qui est située entre deux omoplates dans le flanc dorsal supérieur des souris, est le principal dépôt de MTD utilisé par les laboratoires de recherche pour étudier la fonction des MTD. Récemment, quelques dépôts de MTD jusqu’alors inconnus ont été identifiés chez la souris, dont un analogue au tissu adipeux brun supraclaviculaire humain. Contrairement à iBAT, le tissu adipeux brun supraclaviculaire murin (scBAT) est situé dans la couche intermédiaire du cou et n’est donc pas accessible aussi facilement.
Pour faciliter l’étude des scBAT de souris nouvellement identifiées, un protocole détaillant les étapes de dissection des scBAT intactes de souris postnatales et adultes est présenté. En raison de la petite taille du scBAT par rapport aux autres dépôts adipeux, les procédures ont été modifiées et optimisées spécifiquement pour le traitement du scBAT. Parmi ces modifications, il y a l’utilisation d’un microscope à dissection pendant le prélèvement de tissus pour augmenter la précision et l’homogénéisation des échantillons de scBAT congelés afin d’augmenter l’efficacité de l’analyse qPCR ultérieure. Grâce à ces optimisations, l’identification, l’apparence morphologique et la caractérisation moléculaire du scBAT peuvent être déterminées chez la souris.
Introduction
La prévalence croissante de l’obésité aux États-Unis et dans le monde a suscité un grand intérêt pour la compréhension de son étiologie et l’identification de traitements potentiels 1,2. Le tissu adipeux joue un rôle essentiel dans le métabolisme, et la dérégulation du tissu adipeux peut entraîner le développement de l’obésité. Généralement, il existe deux types de tissus adipeux, le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun. Alors que le tissu adipeux blanc (WAT) peut stocker de l’énergie chimique et sécréter des facteurs endocriniens, le tissu adipeux brun (BAT) peut utiliser l’énergie chimique pour génér....
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Protocole
Les procédures animales ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Baylor College of Medicine. Toutes les procédures ont été effectuées sur des souris mâles C57BL/6J âgées de 3 semaines et 3 mois. Avant la dissection, toutes les souris ont été euthanasiées en utilisant la procédure d’euthanasie approuvée au dioxyde de carbone chez les rongeurs. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.
1. Dissection de scBAT
- Placez la carcasse de la souris sur l’établi et nettoyez les ciseaux chirurgic....
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Résultats
Contrairement à l’iBAT, qui est situé dans la couche sous-cutanée du dos entre deux omoplates, le scBAT est situé dans la couche intermédiaire du cou, s’étendant profondément entre les couches de muscle squelettique et la glande salivaire lorsqu’il se développe le long de la veine jugulaire externe (Figure 1A). La dissection de scBAT n’est pas aussi simple que l’iBAT. Nous fournissons ici une procédure détaillée comprenant des étapes cruciales pour disséquer .......
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Discussion
Dans ce protocole, nous présentons en détail les procédures de dissection et de traitement des scBAT pour les analyses H&E et d’expression génique. Comme le scBAT réside dans la couche intermédiaire du cou et se trouve le long des grosses veines, l’isolement de ce dépôt nécessite une technique précise. Plus précisément, pour avoir une vue claire du dépôt, nous recommandons de placer la souris sous un microscope à dissection après l’ouverture du cou. À l’aide d’une paire de pinces à pointe ultrafine pour décoller les scBA.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Ce travail est soutenu par le NIDDK du NIH sous le numéro d’attribution R01DK116899, l’USDA/ARS sous le numéro d’attribution 3092-51000-064-000D et un prix pilote de l’Institut de recherche cardiovasculaire du Baylor College of Medicine. Les organigrammes ont été produits à l’aide de BioRender.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Alcool déshydrant à 95 % (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| Alcool déshydrant à 100 % (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| Plaque PCR à 96 puits | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum Lavage à haute rigueur | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Lavage à faible intensité | de base 7326804 | Bio-Rad | |
| (pour l’enrobage) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Tubes de microcentrifugation sans capuchon 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifugeuse ; | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Instrument de PCR en temps réel | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroforme | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Milieu de montage à faible viscosité | Epredia | 83104 | |
| Eau traitée DEPC | Ambion | AM 9906 | |
| Microscope de dissection | Nikon | ||
| SMZ1500 Solution de dilution de la DNase | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Solution d’élution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 avec paraffine intermédiaire | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0,5 % p/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formule R Milieu d’infiltration paraffine | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hématoxyline | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (pour HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Cassettes d’enrobage | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec’s Pure Ethanol - 200 Proof (pour 70 % d’éthanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1,7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Joints Microseal 'B' (joints adhésifs) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Biologie moléculaire Qualité Eau | Corning | 46-000-CM | |
| Mortier Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (pour solution saline à 0,85 %) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| Spectrophotomètre NanoDrop NanoDrop | Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Section de paraffine Bain de flottation | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldéhyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek Thomas | Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Tampon phosphate salin (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Four sous vide ; | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Apprêt : 36B4 ; (avant) 10 &mu ; M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3' | Base de données Chen lab Oligo | ||
| Amorce : 36B4 (reverse) 10 &mu ; M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3' | Base de données Oligo de Chen lab | ||
| Amorce : Fabp4 (avant) 10 &mu ; M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3' | Chen lab Base de données Oligo | ||
| Amorce : Fabp4 (reverse) 10 &mu ; M 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3' | Chen lab Base de données d’oligos | ||
| Amorce : Glut 4 (amorce directe) 10 &mu ; M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3' | Chen lab Base de données Oligo | ||
| Amorce : Glut 4 (inverse) 10 &mu ; M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3' | Base de données Oligo de Chen lab | ||
| Amorce : PPARg (avant) 10 &mu ; M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3' | Chen lab Base de données Oligo | ||
| Amorce : PPARg (réserve) 10 &mu ; M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3' | Base de données Chen lab Oligo | ||
| Primer : Ppargc1a (reverse) 10 &mu ; M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3' | Base de données Oligo de Chen | ||
| lab Amorce : Ppargc1a(forward) 10 &mu ; M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3' | Base de données Oligo de Chen lab | ||
| Amorce : Ucp1 (avant) 10 &mu ; M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3' | Chen lab Base de données Oligo | ||
| Amorce : Ucp1 (inverse) 10 &mu ; M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3' | |||
| Solution d’isolement d’ARN (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (décontaminant de surface) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| la RNase (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Flacon à scintillation (verre) | Microscopie électronique Sciences | 72632 | |
| Banc de séchage sur lames ; | Electrothermique (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Grille de coloration en acier inoxydable | Microscopie électronique Sciences | 70312-54 | |
| Stéréomicroscope (pour encastrement) | Olympus | SZ51 | |
| Ciseaux Sugiaux | McKesson | 43-1-104 | |
| Pince à dissection droite à pointe superfine | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Lames de microscope | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Transcriptase inverse (comprend un tampon 5x premier brin et une TNT 0,1 M) ; | Seringue Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET avec aiguille 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (mélange maître d’enzymes qPCR) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Kit de coloration manuelle des lames (bocaux) | Microscopie électronique Sciences | SKU : 62540-01 | |
| Toluène | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Pipette de transfert | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
Références
- Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217(2022).
- Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L.
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Réimpressions et autorisations
