Disección, procesamiento histológico y análisis de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino
Summary
Aquí, proporcionamos un procedimiento práctico para diseccionar y realizar análisis histológicos y de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino.
Abstract
La termogénesis mediada por tejido adiposo marrón (BAT) desempeña un papel importante en la regulación del metabolismo, y su morfología y función pueden verse muy afectadas por los estímulos ambientales en ratones y humanos. En la actualidad, la MTD interescapular murina (iBAT), que se encuentra entre dos escápulas en el flanco dorsal superior de los ratones, es el principal depósito de MTD utilizado por los laboratorios de investigación para estudiar la función de las MTD. Recientemente, se identificaron algunos depósitos de MTD previamente desconocidos en ratones, incluido uno análogo al tejido adiposo marrón supraclavicular humano. A diferencia del iBAT, el tejido adiposo marrón supraclavicular murino (scBAT) está situado en la capa intermedia del cuello y, por lo tanto, no se puede acceder a él tan fácilmente.
Para facilitar el estudio de las scBAT de ratón recién identificadas, se presenta un protocolo que detalla los pasos para diseccionar scBAT intacto de ratones postnatales y adultos. Debido al pequeño tamaño de scBAT en relación con otros depósitos adiposos, los procedimientos se han modificado y optimizado específicamente para el procesamiento de scBAT. Entre estas modificaciones se encuentra el uso de un microscopio de disección durante la recolección de tejidos para aumentar la precisión y homogeneización de las muestras congeladas de scBAT para aumentar la eficiencia del análisis de qPCR posterior. Con estas optimizaciones, se puede determinar la identificación, el aspecto morfológico y la caracterización molecular de la scBAT en ratones.
Introduction
La creciente prevalencia de la obesidad en los Estados Unidos y en todo el mundo ha despertado un gran interés en comprender su etiología e identificar posibles tratamientos 1,2. El tejido adiposo desempeña un papel vital en el metabolismo, y la desregulación del tejido adiposo puede conducir al desarrollo de obesidad. Generalmente, hay dos tipos de tejidos adiposos, el tejido adiposo blanco y el marrón. Mientras que el tejido adiposo blanco (WAT) puede almacenar energía química y secretar factores endocrinos, el tejido adiposo marrón (BAT) puede utilizar energía química para generar calor y mantener la temperatura corporal en el frío 3,4. Debido a esta capacidad única, la activación de BAT también puede aumentar el gasto energético y mejorar la sensibilidad a la insulina5.
BAT ejerce su función a través de la termogénesis sin temblores, un proceso mediado por el desacoplamiento de la proteína 1 (UCP1)6. Los mamíferos, incluidos los ratones y los humanos, poseen cantidades variables de BAT. La visión clásica de las MTD es que estos tejidos adiposos son más abundantes en ratones y lactantes que en humanos adultos. iBAT, situado en el flanco dorsal superior entre las escápulas, es el depósito de MTD más estudiado en ratones. Mediante la aplicación de imágenes de radioisótopos y pruebas de biopsia, estudios recientes identificaron varios depósitos de MTD en humanos adultos. Algunos de ellos, incluyendo los depósitos encontrados en la región profunda del cuello y supraclavicular, no habían sido identificados previamente en ratones u otros animales modelo 7,8,9,10,11. Entre estos depósitos de MTD, el scBAT es el depósito que se observa con mayor frecuencia en humanos adultos. Para comprender mejor el origen y la contribución molecular de estos depósitos de MTD recién descubiertos en humanos, es esencial identificar depósitos equivalentes en ratones que permitan manipulaciones genéticas y moleculares para rastrear y probar el papel funcional de estos depósitos. Por lo tanto, nosotros y otros identificamos algunos depósitos de MTD previamente desconocidos en diferentes ubicaciones anatómicas en ratones, incluido el SCBAT12,13, el BAT perivascular torácico14,15, el BAT perirrenal16 y el BAT periaórtico17. El scBAT de ratón se asemeja anatómicamente al scBAT humano y morfológicamente se asemeja al iBAT clásico, expresando altos niveles de UCP112.
A diferencia del iBAT de ratón, que se puede diseccionar fácilmente, el scBAT está situado en la capa intermedia del cuello del ratón, debajo de las glándulas salivales y a lo largo de la vena yugular externa. El aislamiento de este depósito para análisis histológicos y moleculares puede ser un desafío. Aquí, describimos en detalle el procedimiento para diseccionar scBAT de ratones postnatales y adultos y procesar este depósito para el análisis histológico y de expresión génica.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, presentamos en detalle los procedimientos para diseccionar y procesar scBAT para análisis de H&E y expresión génica. Debido a que scBAT reside en la capa intermedia del cuello y se encuentra a lo largo de las venas grandes, el aislamiento de este depósito requiere una técnica precisa. Específicamente, para obtener una visión clara del depósito, recomendamos colocar al ratón bajo un microscopio de disección después de que se haya abierto el cuello. Usando un par de pinzas de punta superfina p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo del NIDDK de los NIH bajo el número de adjudicación R01DK116899, el USDA/ARS bajo el número de adjudicación 3092-51000-064-000D, y un premio piloto del Instituto de Investigación Cardiovascular de la Facultad de Medicina de Baylor. Los diagramas de flujo se produjeron utilizando BioRender.
Materials
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
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