Dissektion, histologisk bearbetning och genuttrycksanalys av murin supraklavikulär brun fettvävnad
Summary
Här tillhandahåller vi en praktisk procedur för att dissekera och utföra histologiska analyser och genuttrycksanalyser av murin supraklavikulär brun fettvävnad.
Abstract
Brun fettvävnad (BAT)-medierad termogenes spelar en viktig roll i regleringen av ämnesomsättningen, och dess morfologi och funktion kan i hög grad påverkas av miljöstimuli hos möss och människor. För närvarande är murin interscapular BAT (iBAT), som ligger mellan två skulderblad i den övre dorsala flanken hos möss, den huvudsakliga BAT-depån som används av forskningslaboratorier för att studera BAT-funktion. Nyligen identifierades några tidigare okända BAT-depåer hos möss, inklusive en som är analog med mänsklig supraklavikulär brun fettvävnad. Till skillnad från iBAT är musmus, supraklavikulär brun fettvävnad (scBAT) belägen i halsens mellanskikt och kan därför inte nås lika lätt.
För att underlätta studien av nyligen identifierade scBAT på möss presenteras här ett protokoll som beskriver stegen för att dissekera intakt scBAT från postnatala och vuxna möss. På grund av scBAT:s lilla storlek i förhållande till andra fettdepåer har procedurerna modifierats och optimerats specifikt för bearbetning av scBAT. Bland dessa modifieringar finns användningen av ett dissekerande mikroskop under vävnadsinsamling för att öka precisionen och homogeniseringen av frysta scBAT-prover för att öka effektiviteten i efterföljande qPCR-analys. Med dessa optimeringar kan identifiering, morfologiskt utseende och molekylär karakterisering av scBAT bestämmas i möss.
Introduction
Den ökande förekomsten av fetma i USA och världen över har väckt ett stort intresse för att förstå dess etiologi och identifiera potentiella behandlingar 1,2. Fettvävnad spelar en viktig roll i ämnesomsättningen, och dysreglering av fettvävnaden kan leda till utveckling av fetma. Generellt finns det två typer av fettvävnad, vit och brun fettvävnad. Medan vit fettvävnad (WAT) kan lagra kemisk energi och utsöndra endokrina faktorer, kan brun fettvävnad (BAT) använda kemisk energi för att generera värme och bibehålla kroppstemperaturen i kyla 3,4. På grund av denna unika förmåga kan aktivering av BAT också öka energiförbrukningen och förbättra insulinkänsligheten5.
BAT utövar sin funktion genom icke-skakande termogenes, en process som förmedlas av frikopplingsprotein 1 (UCP1)6. Däggdjur, inklusive möss och människor, har varierande mängder BAT. Den klassiska uppfattningen om BAT är att dessa fettvävnader är rikligare hos möss och spädbarn än hos vuxna människor. iBAT, som ligger i den övre dorsala flanken mellan skulderbladen, är den mest studerade BAT-depån hos möss. Genom att tillämpa radioisotopavbildning och biopsitester har nyligen genomförda studier identifierat flera BAT-depåer hos vuxna människor. En del av dem, bland annat de depåer som finns i den djupa halsen och supraklavikulära regionen, hade inte tidigare identifierats hos möss eller andra modelldjur 7,8,9,10,11. Bland dessa BAT-depåer är scBAT den mest frekvent förekommande depån hos vuxna människor. För att bättre förstå ursprunget och det molekylära bidraget från dessa nyfunna BAT-depåer hos människor är det viktigt att identifiera likvärdiga depåer hos möss som möjliggör genetiska och molekylära manipulationer för att spåra och testa dessa depåers funktionella roll. Således identifierade vi och andra några tidigare okända BAT-depåer på olika anatomiska platser hos möss, inklusive scBAT12,13, bröstkorgens perivaskulära BAT14,15, perirenala BAT16 och periaorta BAT17. Mus scBAT liknar anatomiskt mänsklig scBAT och liknar morfologiskt klassisk iBAT och uttrycker höga nivåer av UCP112.
Till skillnad från mus iBAT, som lätt kan dissekeras, är scBAT beläget i det mellanliggande lagret av mushalsen, under spottkörtlarna och längs den yttre halsvenen. Isolering av denna depå för histologiska och molekylära analyser kan vara utmanande. Här beskriver vi i detalj proceduren för att dissekera scBAT från postnatala och vuxna möss och bearbeta denna depå för histologi och genuttrycksanalys.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll presenterar vi i detalj procedurerna för dissekering och bearbetning av scBAT för H&E och genuttrycksanalyser. Eftersom scBAT ligger i halsens mellanskikt och ligger längs de stora venerna, kräver isoleringen av denna depå exakt teknik. För att få en tydlig bild av depån rekommenderar vi att du placerar musen under ett dissekerande mikroskop efter att halsen har öppnats. Använd en superfin pincett för att dra bort scBAT från spottkörteln och omgivande vener, var försiktig så att venerna i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIDDK från NIH under utmärkelsenummer R01DK116899, USDA/ARS under tilldelningsnummer 3092-51000-064-000D och ett pilotpris från Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. Flödesschemana producerades med hjälp av BioRender.
Materials
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
- Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217 (2022).
- Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
- Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
- Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530 (2021).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166 (2017).
- Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370 (2021).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796 (2017).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).
