Fabricage van gedecellulariseerde miltmatrix afgeleid van ratten
Summary
De gedecellulariseerde miltmatrix (DSM) bevat veelbelovende toepassingen op het gebied van leverweefselmanipulatie. Dit protocol schetst de procedure voor het bereiden van DSM bij ratten, waaronder het oogsten van milten van ratten, het decellulariseren ervan door middel van perfusie en het evalueren van de resulterende DSM om de kenmerken ervan te bevestigen.
Abstract
Levertransplantatie is de primaire behandeling voor leverziekte in het eindstadium. Het tekort aan en de ontoereikende kwaliteit van donororganen maken de ontwikkeling van alternatieve therapieën echter noodzakelijk. Biokunstmatige levers (BAL’s) die gebruik maken van gedecellulariseerde levermatrix (DLM) zijn naar voren gekomen als veelbelovende oplossingen. Het vinden van geschikte DLM’s blijft echter een uitdaging. Het gebruik van een gedecellulariseerde miltmatrix (DSM) is onderzocht als basis voor BAL’s en biedt een direct beschikbaar alternatief. In deze studie werden milten van ratten geoogst en gedecellulariseerd met behulp van een combinatie van vries-dooicycli en perfusie met decellularisatiereagentia. Het protocol bewaarde de microstructuren en componenten van de extracellulaire matrix (ECM) binnen de DSM. Het volledige decellularisatieproces duurde ongeveer 11 uur, wat resulteerde in een intacte ECM binnen de DSM. Histologische analyse bevestigde de verwijdering van cellulaire componenten met behoud van de structuur en samenstelling van de ECM. Het gepresenteerde protocol biedt een uitgebreide methode voor het verkrijgen van DSM en biedt mogelijke toepassingen in leverweefselmanipulatie en celtherapie. Deze bevindingen dragen bij aan de ontwikkeling van alternatieve benaderingen voor de behandeling van leverziekte in het eindstadium.
Introduction
Levertransplantatie blijft de enige definitieve behandeling voor leverziekte in het eindstadium 1,2,3. Het kritieke tekort en de afnemende kwaliteit van donororganen hebben de behoefte aan alternatieve behandelingen echter vergroot4. Op het gebied van regeneratieve geneeskunde zijn biokunstmatige levers (BAL’s) die gebruik maken van gedecellulariseerde levermatrix (DLM) naar voren gekomen als veelbelovende oplossingen 5,6,7. De DLM behoudt de oorspronkelijke leverstructuur, inclusief het ingewikkelde microvasculaire netwerk en componenten van de ECM, en biedt een steiger voor het creëren van transplanteerbare BAL’s die mogelijk leverziekten zouden kunnen verlichten.
Ondanks de belofte staat de acceptatie van deze technologie voor uitdagingen, met name bij het vinden van geschikte DLM’s. Er is een tekort aan DLM’s van menselijke oorsprong, terwijl die uit dierlijke bronnen de risico’s van ziekteoverdracht en afstoting van het immuunsysteem met zich meebrengen. In een innovatieve benadering heeft ons onderzoek het gebruik van een gedecellulariseerde miltmatrix (DSM) als basis voor BAL’s 8,9,10,11 verkend. Milten zijn gemakkelijker beschikbaar in verschillende medische situaties, zoals portale hypertensie, traumatische ruptuur, idiopathische trombocytopenische purpura en donatie na hartdood. Daarom zijn milten op grotere schaal beschikbaar dan levers voor onderzoeksdoeleinden. Patiënten die splenectomieën hebben ondergaan, lijden niet aan ernstige aandoeningen, wat de overbodigheid van de milt verder bevestigt. De micro-omgeving van de milt, met name de extracellulaire matrix en sinusoïden, is vergelijkbaar met die van de lever. Dit maakt de milt een geschikt orgaan voor celadhesie en proliferatie in onderzoek naar hepatocyttransplantatie. Op basis van deze bevindingen hebben onze eerdere onderzoeken aangetoond dat DSM’s vergelijkbare microstructuren en componenten delen met DLM’s en de overleving en functie van hepatocyten kunnen ondersteunen, waaronder de productie van albumine en ureum. Bovendien is aangetoond dat DSM’s de leverdifferentiatie van mesenchymale stamcellen in het beenmerg verbeteren, wat leidt tot een verbeterde en consistente functionaliteit.
Door gebruik te maken van DSM’s die met heparine zijn behandeld, hebben we functionele BAL’s ontwikkeld die in staat zijn om effectieve antistolling op korte termijn en gedeeltelijke compensatie van de leverfunctie aan tetonen11. Bijgevolg is deze driedimensionale DSM veelbelovend voor de vooruitgang van leverweefselmanipulatie en celtherapie. In dit werk presenteren we de gedetailleerde methoden voor het oogsten van rattenmilten en het bereiden van DSM die de microstructuren en componenten van de ECM behouden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De BAL’s vertegenwoordigen een effectieve aanpak voor de behandeling van leverziekte in het eindstadium, met name in gevallen waarin levertransplantatie wordt belemmerd door het huidige tekort aan donororganen6. Een veelbelovende optie voor het maken van BAL’s is het gebruik van DLM, dat de natuurlijke ECM en vasculaire structuur van de natuurlijke lever behoudt. De schaarste aan humane DLM en de potentiële risico’s van infectie en immunogeniciteit geassocieerd met DLM bij dieren vormen echter aa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82000624), Natural Science Basic Research Program of Shaanxi (2022JQ-899 & 2021JM-268), Shaanxi Province Innovation Capability Support Program (2023KJXX-030), Shaanxi Province Key R&D Plan University Joint Project-Key Project (2021GXLH-Z-047), Institutional Foundation of The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (2021HL-42 & 2021HL-21).
Materials
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
References
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285 (2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972 (2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003 (2019).
- Somuncu, &. #. 2. 1. 4. ;. Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299 (2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
