ייצור מטריצת טחול דה-צלולרית שמקורה בחולדות
Summary
מטריצת הטחול הדה-צלולרית (DSM) טומנת בחובה יישומים מבטיחים בתחום הנדסת רקמת הכבד. פרוטוקול זה מתאר את ההליך להכנת DSM של חולדות, הכולל קצירת טחול של חולדות, דה-צלולריזציה שלהם באמצעות זילוח והערכת ה-DSM המתקבל כדי לאשר את מאפייניו.
Abstract
השתלת כבד היא הטיפול העיקרי במחלת כבד סופנית. עם זאת, המחסור והאיכות הלקויה של איברים מתורמים מחייבים פיתוח טיפולים אלטרנטיביים. כבדים ביו-מלאכותיים (BALs) המשתמשים במטריצת כבד דה-צלולרית (DLM) התגלו כפתרונות מבטיחים. עם זאת, מיקור DLM מתאים נותר מאתגר. השימוש במטריצת טחול דה-צלולרית (DSM) נחקר כבסיס ל-BALs, ומציע חלופה זמינה. במחקר זה, טחול חולדות נקצר ועבר דה-צלולריזציה באמצעות שילוב של מחזורי הקפאה-הפשרה וזילוח עם ריאגנטים של דה-צלולריזציה. הפרוטוקול שימר את המיקרו-מבנים והרכיבים של המטריצה החוץ תאית (ECM) בתוך ה-DSM. תהליך הדה-צלולריזציה המלא ארך כ-11 שעות, והתוצאה הייתה ECM שלם בתוך ה-DSM. ניתוח היסטולוגי אישר את הסרת רכיבי התא תוך שמירה על מבנה ECM והרכבו. הפרוטוקול המוצג מספק שיטה מקיפה להשגת DSM, ומציע יישומים פוטנציאליים בהנדסת רקמות כבד ותרפיה תאית. ממצאים אלה תורמים לפיתוח גישות חלופיות לטיפול במחלת כבד סופנית.
Introduction
השתלת כבד נותרה הטיפול הסופי היחיד למחלת כבד סופנית 1,2,3. עם זאת, המחסור הקריטי והאיכות הירודה של תרומת איברים הגבירו את הצורך בטיפולים אלטרנטיביים4. בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כבדים ביו-מלאכותיים (BALs) המשתמשים במטריצת כבד דה-צלולרית (DLM) התגלו כפתרונות מבטיחים 5,6,7. ה- DLM משמר את מבנה הכבד המקורי, כולל הרשת המיקרו-וסקולרית המורכבת שלו ורכיבי ה- ECM, ומציע פיגום ליצירת BAL להשתלה שעשויה להקל על מחלות כבד.
למרות ההבטחה, אימוץ טכנולוגיה זו עומד בפני אתגרים, במיוחד במיקור DLM מתאימים. DLMs שמקורם בבני אדם נמצאים במחסור, בעוד אלה ממקורות מן החי נושאים את הסיכונים של העברת מחלות ודחייה חיסונית. בגישה חדשנית, המחקר שלנו בחן את השימוש במטריצת טחול דה-צלולרית (DSM) כבסיס ל-BALs 8,9,10,11. הטחול זמין יותר במצבים רפואיים שונים, כגון יתר לחץ דם פורטלי, קרע טראומטי, פורפורה טרומבוציטופנית אידיופטית, ותרומה לאחר מוות לבבי. לכן, טחול זמין באופן נרחב יותר מאשר כבד למטרות מחקר. חולים שעברו כריתת טחול אינם סובלים מתנאים חמורים, מה שמאשר עוד יותר את חיוניות הטחול. המיקרו-סביבה של הטחול, במיוחד המטריצה החוץ-תאית והסינוסואידים, דומה לזו של הכבד. זה הופך את הטחול לאיבר מתאים להידבקות תאים והתפשטות במחקר השתלת הפטוציטים. בהתבסס על ממצאים אלה, החקירות הקודמות שלנו הוכיחו כי DSMs חולקים מיקרו-מבנים ורכיבים דומים עם DLMs ויכולים לתמוך בהישרדות ובתפקוד של הפטוציטים, כולל ייצור אלבומין ואוריאה. יתר על כן, DSMs הוכחו כמשפרים את התמיינות הכבד של תאי גזע מזנכימליים של מח עצם, מה שמוביל לפונקציונליות משופרת ועקבית.
על ידי שימוש ב- DSM המטופלים בהפרין, הנדסנו BALs פונקציונליים המסוגלים להדגים נוגדי קרישה יעילים לטווח קצר ופיצוי חלקי של תפקודי כבד11. כתוצאה מכך, DSM תלת מימדי זה טומן בחובו הבטחה משמעותית לקידום הנדסת רקמות הכבד והטיפול התאי. בעבודה זו אנו מציגים את השיטות המפורטות לקצירת טחול חולדות והכנת DSM המשמרים את המיקרו-מבנים והרכיבים של ה-ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
ה- BALs מייצגים גישה יעילה לטיפול במחלת כבד סופנית, במיוחד במקרים בהם השתלת כבד מעוכבת על ידי המחסור הנוכחי באיברים תורמים6. אפשרות מבטיחה ליצירת BALs היא שימוש ב- DLM, המשמר את ה- ECM הטבעי של הכבד המקומי ואת מבנה כלי הדם. עם זאת, המחסור ב-DLM אנושי והסיכונים הפוטנציאליים של זיהום ואימונ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82000624), תוכנית המחקר הבסיסית במדעי הטבע של שאאנשי (2022JQ-899 &; 2021JM-268), תוכנית התמיכה ביכולת חדשנות במחוז שאאנשי (2023KJXX-030), תוכנית מפתח מו”פ של מחוז שאאנשי פרויקט מפתח משותף של האוניברסיטה (2021GXLH-Z-047), הקרן המוסדית של בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת שיאן ג’יאוטונג (2021HL-42 ו- 2021HL-21).
Materials
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
References
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285 (2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972 (2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003 (2019).
- Somuncu, &. #. 2. 1. 4. ;. Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299 (2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
