ラット由来の脱細胞化脾臓マトリックスの作製
Summary
脱細胞化脾臓マトリックス(DSM)は、肝臓組織工学の分野で有望な用途を持っています。このプロトコルは、ラットの脾臓を採取し、灌流によって脱細胞化し、得られたDSMを評価してその特性を確認することを含む、ラットDSMを準備する手順を概説しています。
Abstract
肝移植は、末期肝疾患の一次治療です。しかし、ドナー臓器の不足と質の低さから、代替療法の開発が求められています。脱細胞化肝マトリックス(DLM)を利用した生物人工肝臓(BAL)が有望な解決策として浮上しています。しかし、適切なDLMの調達は依然として困難です。脱細胞化脾臓マトリックス(DSM)の使用は、BALの基盤として検討されており、すぐに利用できる代替手段を提供しています。この研究では、凍結融解サイクルと脱細胞化試薬との灌流の組み合わせを使用して、ラットの脾臓を採取し、脱細胞化しました。このプロトコルは、DSM内の細胞外マトリックス(ECM)の微細構造と成分を保存しました。完全な脱細胞化プロセスには約11時間かかり、DSM内に無傷のECMが得られました。組織学的分析により、ECMの構造と組成を維持しながら細胞成分が除去されることが確認されました。提示されたプロトコルは、DSMを取得するための包括的な方法を提供し、肝臓組織工学および細胞療法における潜在的なアプリケーションを提供します。これらの知見は、末期肝疾患の治療のための代替アプローチの開発に貢献します。
Introduction
肝移植は、末期肝疾患の唯一の決定的な治療法です1,2,3。しかし、ドナー臓器の深刻な不足と質の低下により、代替治療の必要性が高まっています4。再生医療の分野では、脱細胞化肝マトリックス(DLM)を利用したバイオ人工肝臓(BAL)が有望な解決策として浮上しています5,6,7。DLMは、複雑な微小血管ネットワークやECMの構成要素など、元の肝臓構造を保存し、肝疾患を緩和する可能性のある移植可能なBALを作成するための足場を提供します。
この技術の採用は、特に適切なDLMの調達において課題に直面しており、ヒト由来のDLMは不足しており、動物由来のDLMは病気の伝染や免疫拒絶のリスクを伴います。革新的なアプローチで、私たちの研究は、BAL8、9、10、11の基盤として脱細胞化脾臓マトリックス(DSM)の使用を検討しました。脾臓は、門脈圧亢進症、外傷性破裂、特発性血小板減少性紫斑病、心臓死後の提供など、さまざまな医学的状況でより容易に利用できます。したがって、脾臓は研究目的で肝臓よりも広く利用可能です。脾臓摘出術を受けた患者は重篤な状態に罹患しておらず、脾臓のディスペンサビリティをさらに確認しています。脾臓、特に細胞外マトリックスと正弦波の微小環境は、肝臓の微小環境と似ています。これにより、脾臓は肝細胞移植研究における細胞接着と増殖に適した器官になります。これらの発見に基づいて、私たちの以前の調査では、DSMがDLMと同等の微細構造と成分を共有し、アルブミンや尿素産生を含む肝細胞の生存と機能をサポートできることが実証されました。さらに、DSMは骨髄間葉系幹細胞の肝分化を促進し、改善された一貫した機能をもたらすことが示されています。
ヘパリンで処理されたDSMを採用することにより、効果的な短期抗凝固療法および部分的な肝機能補償を実証できる機能性BALを設計しました11。したがって、この3次元DSMは、肝臓組織工学と細胞治療の進歩に大きな期待を寄せています。この研究では、ラットの脾臓を採取し、ECMの微細構造と成分を保存するDSMを調製する詳細な方法を紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
BALは、末期肝疾患の治療に効果的なアプローチであり、特に現在のドナー臓器不足によって肝移植が妨げられている場合に有効です6。BALを作成するための有望なオプションは、天然の肝臓の自然なECMと血管構造を保存するDLMの利用です。しかし、ヒトDLMの希少性と、動物DLMに関連する感染と免疫原性の潜在的なリスクは、重大な制限をもたらします。この課題に対処するた…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学基金会(82000624)、陝西省自然科学基礎研究プログラム(2022JQ-899および2021JM-268)、陝西省イノベーション能力支援プログラム(2023KJXX-030)、陝西省重点研究開発計画大学共同プロジェクト-重点プロジェクト(2021GXLH-Z-047)、西安交通大学第一付属病院の制度的設立(2021HL-42および2021HL-21)の支援を受けました。
Materials
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
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