Fabricação de matriz de baço descelularizada derivada de ratos
Summary
A matriz descelularizada do baço (DSM) tem aplicações promissoras no campo da engenharia de tecidos hepáticos. Este protocolo descreve o procedimento para preparar o DSM de ratos, que inclui a coleta de baços de ratos, descelularizando-os por meio de perfusão e avaliando o DSM resultante para confirmar suas características.
Abstract
O transplante de fígado é o tratamento primário para a doença hepática em estágio terminal. No entanto, a escassez e a qualidade inadequada dos órgãos dos dadores exigem o desenvolvimento de terapias alternativas. Fígados bioartificiais (BALs) utilizando matriz hepática descelularizada (DLM) surgiram como soluções promissoras. No entanto, o fornecimento de DLMs adequados continua sendo um desafio. O uso de uma matriz esplênica descelularizada (DSM) tem sido explorado como base para LBAs, oferecendo uma alternativa prontamente disponível. Neste estudo, os baços de ratos foram colhidos e descelularizados usando uma combinação de ciclos de congelamento e descongelamento e perfusão com reagentes de descelularização. O protocolo preservou as microestruturas e componentes da matriz extracelular (MEC) dentro do DSM. O processo completo de descelularização levou aproximadamente 11 h, resultando em uma ECM intacta dentro do DSM. A análise histológica confirmou a remoção de componentes celulares, mantendo a estrutura e composição da MEC. O protocolo apresentado fornece um método abrangente para a obtenção do DSM, oferecendo aplicações potenciais em engenharia de tecidos hepáticos e terapia celular. Esses achados contribuem para o desenvolvimento de abordagens alternativas para o tratamento da doença hepática terminal.
Introduction
O transplante de fígado continua sendo o único tratamento definitivo para a doença hepática terminal 1,2,3. No entanto, a escassez crítica e o declínio da qualidade dos órgãos dos doadores aumentaram a necessidade de tratamentos alternativos4. No campo da medicina regenerativa, fígados bioartificiais (BALs) utilizando matriz hepática descelularizada (DLM) surgiram como soluções promissoras 5,6,7. O DLM preserva a estrutura original do fígado, incluindo sua intrincada rede microvascular e componentes da MEC, oferecendo um andaime para a criação de BALs transplantáveis que poderiam potencialmente aliviar doenças hepáticas.
Apesar da promessa, a adoção dessa tecnologia enfrenta desafios, principalmente no fornecimento de DLMs adequados. Os DLMs derivados de humanos são escassos, enquanto os de origem animal apresentam riscos de transmissão de doenças e rejeição imunológica. Em uma abordagem inovadora, nossa pesquisa explorou o uso de uma matriz de baço descelularizada (DSM) como base para LBAs 8,9,10,11. Os baços estão mais prontamente disponíveis em várias situações médicas, como hipertensão portal, ruptura traumática, púrpura trombocitopênica idiopática e doação após morte cardíaca. Portanto, os baços estão mais amplamente disponíveis do que os fígados para fins de pesquisa. Os pacientes submetidos a esplenectomias não sofrem de condições graves, confirmando ainda mais a dispensabilidade do baço. O microambiente do baço, particularmente a matriz extracelular e os sinusóides, é semelhante ao do fígado. Isso torna o baço um órgão adequado para adesão e proliferação celular na pesquisa de transplante de hepatócitos. Com base nessas descobertas, nossas investigações anteriores demonstraram que os DSMs compartilham microestruturas e componentes comparáveis com os DLMs e podem apoiar a sobrevivência e a função dos hepatócitos, incluindo a produção de albumina e ureia. Além disso, os DSMs demonstraram aumentar a diferenciação hepática das células-tronco mesenquimais da medula óssea, levando a uma funcionalidade aprimorada e consistente.
Ao empregar DSMs tratados com heparina, projetamos LBAs funcionais capazes de demonstrar anticoagulação eficaz em curto prazo e compensação parcial da função hepática11. Consequentemente, este DSM tridimensional é uma promessa significativa para o avanço da engenharia de tecidos hepáticos e terapia celular. Neste trabalho, apresentamos os métodos detalhados de coleta de baços de ratos e preparação de DSM que preservam as microestruturas e componentes da MEC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os LBAs representam uma abordagem eficaz para o tratamento da doença hepática terminal, particularmente nos casos em que o transplante de fígado é dificultado pela atual escassez de órgãos de doadores6. Uma opção promissora para a criação de LBAs é a utilização de DLM, que preserva a ECM natural e a estrutura vascular do fígado nativo. No entanto, a escassez de DLM humano e os riscos potenciais de infecção e imunogenicidade associados ao DLM animal apresentam limitações significa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82000624), Programa de Pesquisa Básica em Ciências Naturais de Shaanxi (2022JQ-899 e 2021JM-268), Programa de Apoio à Capacidade de Inovação da Província de Shaanxi (2023KJXX-030), Plano de P&D da Província de Shaanxi Projeto Conjunto da Universidade – Projeto Chave (2021GXLH-Z-047), Fundação Institucional do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Xi’an Jiaotong (2021HL-42 e 2021HL-21).
Materials
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
References
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285 (2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972 (2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003 (2019).
- Somuncu, &. #. 2. 1. 4. ;. Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299 (2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
