Sıçanlardan Türetilen Decellularized Spleen Matrix'in İmalatı
Summary
Hücrelerden arındırılmış dalak matrisi (DSM), karaciğer doku mühendisliği alanında umut verici uygulamalara sahiptir. Bu protokol, sıçan dalaklarının hasat edilmesini, perfüzyon yoluyla hücrelerden arındırılmasını ve özelliklerini doğrulamak için elde edilen DSM’nin değerlendirilmesini içeren sıçan DSM’si hazırlama prosedürünü ana hatlarıyla belirtir.
Abstract
Karaciğer nakli, son dönem karaciğer hastalığının birincil tedavisidir. Bununla birlikte, donör organların azlığı ve yetersiz kalitesi, alternatif tedavilerin geliştirilmesini zorunlu kılmaktadır. Deselüler karaciğer matriksi (DLM) kullanan biyoyapay karaciğerler (BAL’lar) umut verici çözümler olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, uygun DLM’leri tedarik etmek zor olmaya devam etmektedir. Hücreden arındırılmış dalak matrisinin (DSM) kullanımı, BAL’lar için bir temel olarak araştırılmıştır ve hazır bir alternatif sunar. Bu çalışmada, sıçan dalakları, donma-çözülme döngüleri ve hücre giderme reaktifleri ile perfüzyonun bir kombinasyonu kullanılarak hasat edildi ve hücrelerden arındırıldı. Protokol, DSM içindeki hücre dışı matrisin (ECM) mikro yapılarını ve bileşenlerini korudu. Tam hücre çözme işlemi yaklaşık 11 saat sürdü ve bu da DSM içinde sağlam bir ECM ile sonuçlandı. Histolojik analiz, ECM’nin yapısını ve bileşimini korurken hücresel bileşenlerin çıkarıldığını doğruladı. Sunulan protokol, karaciğer dokusu mühendisliği ve hücre tedavisinde potansiyel uygulamalar sunan DSM elde etmek için kapsamlı bir yöntem sağlar. Bu bulgular son dönem karaciğer hastalığının tedavisi için alternatif yaklaşımların geliştirilmesine katkıda bulunmaktadır.
Introduction
Karaciğer nakli, son dönem karaciğer hastalığı için tek kesin tedavi olmaya devam etmektedir 1,2,3. Bununla birlikte, donör organların kritik kıtlığı ve azalan kalitesi, alternatif tedavilere olan ihtiyacı artırmıştır4. Rejeneratif tıp alanında, hücreden arındırılmış karaciğer matrisi (DLM) kullanan biyoyapay karaciğerler (BAL’ler) umut verici çözümler olarak ortaya çıkmıştır 5,6,7. DLM, karmaşık mikrovasküler ağı ve ECM’nin bileşenleri de dahil olmak üzere orijinal karaciğer yapısını koruyarak, karaciğer hastalıklarını potansiyel olarak hafifletebilecek nakledilebilir BAL’lar oluşturmak için bir iskele sunar.
Verilen söze rağmen, bu teknolojinin benimsenmesi, özellikle uygun DLM’lerin tedarik edilmesinde zorluklarla karşı karşıyadır. İnsan kaynaklı DLM’ler yetersizdir, hayvan kaynaklı DLM’ler ise hastalık bulaşma ve bağışıklık reddi riskleri taşır. Yenilikçi bir yaklaşımla, araştırmamız BALs 8,9,10,11 için bir temel olarak hücreden arındırılmış bir dalak matrisinin (DSM) kullanımını araştırdı. Dalaklar, portal hipertansiyon, travmatik rüptür, idiyopatik trombositopenik purpura ve kardiyak ölüm sonrası bağış gibi çeşitli tıbbi durumlarda daha kolay bulunur. Bu nedenle dalaklar, araştırma amaçlı karaciğerlerden daha yaygın olarak bulunur. Splenektomi geçiren hastalar ciddi durumlardan muzdarip değildir, bu da dalağın dağıtılabilirliğini daha da doğrular. Dalağın mikro çevresi, özellikle hücre dışı matriks ve sinüzoidler, karaciğerinkine benzer. Bu, dalağı hepatosit nakli araştırmalarında hücre yapışması ve çoğalması için uygun bir organ haline getirir. Bu bulgulara dayanarak, önceki araştırmalarımız DSM’lerin DLM’lerle karşılaştırılabilir mikro yapıları ve bileşenleri paylaştığını ve albümin ve üre üretimi dahil olmak üzere hepatositlerin hayatta kalmasını ve işlevini destekleyebileceğini göstermiştir. Ayrıca, DSM’lerin kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin hepatik farklılaşmasını arttırdığı, bunun da gelişmiş ve tutarlı işlevsellik sağladığı gösterilmiştir.
Heparin ile tedavi edilen DSM’leri kullanarak, etkili kısa süreli antikoagülasyon ve kısmi karaciğer fonksiyon kompanzasyonu gösterebilen fonksiyonel BAL’lar tasarladık11. Sonuç olarak, bu üç boyutlu DSM, karaciğer dokusu mühendisliği ve hücre tedavisinin ilerlemesi için önemli bir umut vaat ediyor. Bu çalışmada, ECM’nin mikro yapılarını ve bileşenlerini koruyan sıçan dalaklarının toplanması ve DSM’nin hazırlanmasının ayrıntılı yöntemlerini sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
BAL’lar, özellikle karaciğer naklinin mevcut donör organ eksikliği nedeniyle engellendiği durumlarda, son dönem karaciğer hastalığının tedavisi için etkili bir yaklaşımı temsil etmektedir6. BAL’lar oluşturmak için umut verici bir seçenek, doğal karaciğerin doğal ECM’sini ve vasküler yapısını koruyan DLM’nin kullanılmasıdır. Bununla birlikte, insan DLM’sinin kıtlığı ve hayvan DLM’si ile ilişkili potansiyel enfeksiyon ve immünojenisite riskleri önemli sınırlamala…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82000624), Shaanxi Doğa Bilimleri Temel Araştırma Programı (2022JQ-899 ve 2021JM-268), Shaanxi Eyaleti İnovasyon Yeteneği Destek Programı (2023KJXX-030), Shaanxi Eyaleti Anahtar Ar-Ge Planı Üniversitesi Ortak Proje-Anahtar Projesi (2021GXLH-Z-047), Xi’an Jiaotong Üniversitesi İlk Bağlı Hastanesinin Kurumsal Vakfı (2021HL-42 ve 2021HL-21) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
References
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285 (2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972 (2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003 (2019).
- Somuncu, &. #. 2. 1. 4. ;. Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299 (2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
