Differenziamento e caratterizzazione di osteoclasti da cellule staminali pluripotenti indotte umane
Summary
Questo protocollo presenta il differenziamento degli osteoclasti umani dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e descrive i metodi per la caratterizzazione degli osteoclasti e dei precursori degli osteoclasti.
Abstract
Questo protocollo descrive in dettaglio la propagazione e il passaggio delle iPSC umane e la loro differenziazione in osteoclasti. In primo luogo, le iPSC vengono dissociate in una sospensione unicellulare per un ulteriore utilizzo nell’induzione del corpo embrioide. A seguito dell’induzione mesodermica, i corpi embrioidi subiscono una differenziazione ematopoietica, producendo una popolazione di cellule ematopoietiche fluttuanti. Successivamente, le cellule ematopoietiche prelevate subiscono una fase di maturazione del fattore stimolante le colonie di macrofagi e, infine, il differenziamento degli osteoclasti. Dopo la differenziazione degli osteoclasti, gli osteoclasti sono caratterizzati dalla colorazione per TRAP in combinazione con una colorazione nucleare verde metile. Gli osteoclasti sono osservati come policarioni TRAP+ multinucleati. La loro identificazione può essere ulteriormente supportata dalla colorazione con la catepsina K. I saggi di riassorbimento osseo e minerale consentono la caratterizzazione funzionale, confermando l’identità degli osteoclasti in buona fede. Questo protocollo dimostra un metodo robusto e versatile per differenziare gli osteoclasti umani dalle iPSC e ne consente una facile adozione in applicazioni che richiedono grandi quantità di osteoclasti umani funzionali. Potrebbero essere previste applicazioni nei settori della ricerca sulle ossa, sul cancro, sull’ingegneria tissutale e sulla ricerca sulle endoprotesi.
Introduction
Gli osteoclasti (OC) sono tipi di cellule di derivazione ematopoietica 1,2, versatili che sono comunemente usati dai ricercatori in aree come la ricerca sulle malattie ossee 3,4, la ricerca sul cancro 5,6, l’ingegneria tissutale 7,8 e la ricerca sull’endoprotesi 9,10. Ciononostante, il differenziamento degli OC può essere impegnativo in quanto la fusione di precursori mononucleari in OC multinucleati è necessaria per creare OC funzionali11. Diversi fattori biologici, come l’attivatore del recettore del ligando NF-κB (RANKL) e il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), sono necessari per la differenziazione dell’OC. È stato riportato che M-CSF ha un effetto positivo sulla proliferazione cellulare, sulla sopravvivenza cellulare e sull’espressione di RANK 12,13,14. D’altra parte, RANKL si lega a RANK, che attiva cascate di segnalazione a valle che inducono l’osteoclastogenesi. L’attivazione è mediata dal fattore 6 associato al recettore del TNF (TRAF6), che porta alla degradazione del fattore nucleare del potenziatore genico del polipeptide leggero kappa nell’inibitore delle cellule B, alfa (IκB-α), una proteina legante che lega i dimeri NF-kB16,17. Quindi, la degradazione di IκB-α rilascia dimeri di NF-kB, che poi traslocano nel nucleo e inducono l’espressione dei fattori di trascrizione c-Fos e del fattore nucleare delle cellule T attivate 1 (NFATc1). Questo, a sua volta, innesca la trascrizione di una moltitudine di proteine correlate al differenziamento OC15,18. Le proteine sovraregolate come DC-Stamp e Atp6v0d2 mediano la fusione cellula-cellula dei precursori OC, portando alla formazione del sincizio 19,20,21.
Per quanto riguarda le cellule primarie umane, le PBMC CD34+ e CD14+ sono attualmente i tipi cellulari più utilizzati per il differenziamento in OC22. Tuttavia, questo approccio è limitato dall’eterogeneità all’interno della popolazione CD34+ di cellule raccolte da donatori23 e dalla loro limitata espandibilità. Le iPSC umane rappresentano una fonte alternativa per gli OC. Poiché possono essere propagati indefinitamente24, consentono l’espandibilità e l’upscaling della produzione di OC. Ciò consente la differenziazione di un gran numero di OC, il che facilita la ricerca OC.
Sono stati pubblicati diversi protocolli per la differenziazione delle iPSC in OC 25,26,27. L’intero processo di differenziazione può essere suddiviso in una parte di propagazione delle iPSC, una parte di differenziazione mesodermica ed ematopoietica e una parte di differenziazione OC. La propagazione delle iPSC prima del processo di differenziazione consente l’aumento della produzione di OC prima della differenziazione. Esistono diversi approcci per quanto riguarda il differenziamento mesodermico ed ematopoietico. Tradizionalmente, la formazione di corpi embrioidi (EB) è stata utilizzata per differenziare le cellule ematopoietiche, ma gli approcci basati sul monostrato rappresentano un’altra strategia di differenziamento ematopoietico che non richiede l’induzione di EB. Ciononostante, i sistemi basati su monostrato sembrano richiedere un’ulteriore ottimizzazione, poiché noi e altri abbiamo trovato gli approcci basati sull’EB più robusti per la differenziazione degli OC.
Qui, descriviamo la differenziazione delle OC dalle iPSC umane utilizzando un protocollo basato su EB. Questo protocollo è stato adattato da Rössler et al.26 e modificato per aumentare la robustezza e consentire la crioconservazione durante il processo di differenziazione. In primo luogo, abbiamo raccolto cellule ematopoietiche solo una volta dopo 10 giorni di differenziazione. Le cellule ematopoietiche sono state quindi crioconservate per consentire una maggiore flessibilità durante il processo di differenziazione. Inoltre, abbiamo aumentato la densità di semina delle cellule ematopoietiche da 1 x 105 a 2 x 105 cellule/cm2 per la differenziazione OC. È stato utilizzato un terreno umano più recente privo di siero iPSC (hiPSC-SFM, vedi Tabella dei materiali) e il rivestimento dei pozzetti è stato eseguito con 200-300 μg/mL di un estratto di membrana basale (vedi Tabella dei materiali) invece dello 0,1% di gelatina. La penicillina/streptomicina non è stata aggiunta ai media.
Il protocollo di Rössler et al.26 è stato originariamente adattato da una iPSC a un protocollo di differenziazione dei macrofagi28 che utilizza la formazione di EB per la differenziazione ematopoietica. Mentre la formazione di EB è stata utilizzata per un lungo periodo di tempo dai ricercatori per la differenziazione ematopoietica29,30, in letteratura sono stati descritti diversi metodi di induzione di EB, come l’aggregazione spontanea, la centrifugazione in una piastra a pozzetti a fondo tondo, la coltura a goccia sospesa, la coltura di bioreattori, la coltura di tubi conici, il vaso laterale a rotazione lenta e la coltura di gel micromold31. Questo protocollo utilizza la centrifugazione di iPSC dissociate in una piastra a pozzetti a fondo tondo per avvicinare le singole cellule iPSC l’una all’altra e consentire la formazione di sfere (EB), come descritto di seguito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo offre un metodo affidabile e robusto per differenziare le iPSC in OC. Tuttavia, ci sono diverse insidie che si possono incontrare durante il processo di differenziazione. Le linee di iPSC umane generate da cellule di diversa origine tissutale sono state differenziate con successo utilizzando questo protocollo33. Quando si congelano le iPSC (vedere il passaggio del protocollo “3. Congelamento delle iPSC”), un pozzetto nel punto di passaggio è stato congelato in un crioviale. Dura…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Giachelli per il loro aiuto tecnico e supporto. Ringraziamo il Centro di Microscopia W. M. Keck e il direttore del Centro Keck, Dr. Nathanial Peters, per l’assistenza nell’ottenere le immagini di microscopia confocale e microscopia a campo largo. Si ringraziano inoltre la UW Flow Core Facility e il Flow Core Facility manager, Aurelio Silvestroni, per il supporto tecnico e l’assistenza. Infine, ringraziamo Hannah Blümke per il supporto con l’illustrazione e il graphic design.
Il finanziamento è stato fornito attraverso la sovvenzione R35 HL139602-01 del National Institutes of Health. Riconosciamo anche la sovvenzione NIH S10, la OD016240 S10 per il finanziamento dello strumento presso il W. M. Keck Center e la sovvenzione NIH 1S10OD024979-01A1 per il finanziamento dello strumento presso la UW Flow Core Facility.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| Antibody – Anti-Cathepsin K | Abcam | ab19027 | |
| Antibody – APC-conjugated Anti-Human CD45 | BD | 555485 | |
| Antibody – APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | |
| Antibody – BV711-conjugated Anti-Human CD14 | BD | 563372 | |
| Antibody – BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD | 563125 | |
| Antibody – Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 | BD | 560710 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557872 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b | Biolegend | 301308 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Antibody – PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 550795 | |
| Antibody – PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Bone Resorption Assay Kit | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Sytems | 3434-010-02 | Basal membrane extract |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| Human IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Human Stem Cell Factor (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | Biolegend | 422301 | |
| Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM α, nucleosides, no phenol red | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Serum free cryopreservation medium |
| mTeSR Plus medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 174925 | Round bottom ultra-low attachment 96-well plate |
| P1000 Wide Bore Tips | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Hematopoietic cell culture medium |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher | 12563011 | Single-cell dissociation reagent |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Bioscience Lonza | 04-418Q | Hematopoietic basal medium |
| µ-Slide 8 Well High | Ibidi | 80806 |
References
- Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
- Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
- Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144 (2021).
- Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895 (2019).
- Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
- Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465 (2013).
- Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913 (2022).
- Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060 (2022).
- Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
- Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
- Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
- Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
- Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
- Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
- Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35 (2015).
- Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
- Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
- Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871 (2009).
- Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337 (2005).
- Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402 (2016).
- Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698 (2023).
- Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
- Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23 (2014).
- Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
- Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
- Chen, I. -. P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
- Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
- Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
- Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
- Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595 (2015).
- Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600 (2019).
- Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319 (2023).
- Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087 (2022).
- Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
- Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
- Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
- Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038 (2020).
- Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282 (2019).
- Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631 (2022).
- Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201 (2002).
- Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162 (2021).
- Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109 (2017).
- Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
- Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73 (2014).
