Induktion von kleinen Kolonien in Candida-glabrat mittels bengalischer Rose-vermittelter photodynamischer Therapie
Summary
Die Bedeutung von kleinen Kolonien bei der Arzneimittelresistenz von Candida spp. ist noch nicht vollständig erforscht. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) bietet eine vielversprechende Strategie gegen arzneimittelresistente Pilzinfektionen. Diese Studie zeigt, dass die bengalisch vermittelte aPDT Candida glabrata effektiv deaktiviert und zierliche Kolonien induziert, was ein einzigartiges Verfahren darstellt.
Abstract
Mit einer Sterblichkeitsrate von 40 % bei Candidamie-Patienten stellen arzneimittelresistente Candida und ihre zierlichen Mutanten nach wie vor eine große Herausforderung für die Behandlung dar. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) zielt im Gegensatz zu Antibiotika/Antimykotika auf mehrere Pilzstrukturen ab und kann die Resistenz vereiteln. Traditionelle Methoden zur Induktion kleiner Völker beruhen auf Ethidiumbromid oder Fluconazol, die die Anfälligkeit von Medikamenten und Stressreaktionen beeinflussen können. In dieser Studie wurde die Anwendung von grünem Licht (Peak 520 nm) und Rose Bengal (RB) Photosensibilisator zur Bekämpfung eines arzneimittelresistenten Candida glabrata Isolats untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die aPDT-Behandlung das Zellwachstum signifikant hemmte (≥99,9 % Reduktion) und die Bildung kleiner Kolonien effektiv induzierte, was sich in einer reduzierten Größe und einem Verlust der mitochondrialen Redoxindikatorfärbung zeigte. Diese Studie liefert erste Hinweise darauf, dass aPDT in vitro kleine Kolonien in einem multiresistenten C. glabrata-Stamm induzieren kann, was einen potenziell transformativen Ansatz zur Bekämpfung resistenter Pilzinfektionen bietet.
Introduction
Pilzinfektionen, insbesondere solche, die durch Candida albicans und zunehmend arzneimittelresistente Candida glabrata verursacht werden, stellen eine ernsthafte globale Bedrohung dar1. Diese Infektionen können tödlich sein, insbesondere für Krankenhauspatienten und Patienten mit geschwächtem Immunsystem. Die zunehmende Resistenz gegen Antimykotika bedroht die Kontrolle der invasiven Candidiasis, einer schweren Pilzinfektion mit hoher Mortalität, insbesondere durch Candida albicans2. Resistente Stämme behindern eine wirksame Behandlung, was sowohl die Komplexität als auch die Sterblichkeitsraten erhöhen kann. In Alameda County, Kalifornien, USA, ist C. glabrata die am weitesten verbreitete invasive Art3. Diese Verschiebung in der Prävalenz und Verbreitung von Candida-Arten kann durch die lokalen Gesundheitspraktiken, die Patientendemografie, den Einsatz von Antimykotika und die Prävalenz von Risikofaktoren für Candida-Infektionen beeinflusst werden.
Zierliche Mutanten in Candida, denen funktionelle Mitochondrien fehlen, zeigen, wie diese Organelle die Arzneimittelreaktion, Virulenz und Stressresistenz beeinflusst 4,5. C. glabrata bildet diese Kolonien bereitwillig und gewinnt an Empfindlichkeit gegenüber Polyenen, verliert sie aber an Azole6. Die Empfindlichkeit von Azolen und die Atmungsfunktion sind eng miteinander verknüpft, wobei eine verminderte Atmung über den Verlust der mitochondrialen DNA zu einer Resistenz führt7. Kleine Kolonien von C. glabrata mit Azolresistenz wurden aus menschlichen Stuhlproben eines Empfängers eines Knochenmarktransplantats, der sich einer Fluconazol-Behandlung unterzog8, und aus Blutkulturflaschen von Patienten mit Blutbahninfektionenisoliert 9. Ihre potenziellen Auswirkungen auf Arzneimittelresistenz, Virulenz und Stressreaktion unterstreichen ihre klinische Bedeutung. Darüber hinaus machen sie ihre unterschiedlichen Eigenschaften zu wertvollen Werkzeugen für die Untersuchung grundlegender Fragen der Mitochondrienbiologie5. Mit der fortschreitenden Forschung an zierlichen Mutanten werden sich ihre Anwendungen sowohl in der klinischen als auch in der Grundlagenforschung wahrscheinlich erweitern.
Diese Studie entdeckte, dass die photodynamische Therapie (PDT) winzige Kolonien in C. glabrata induzieren kann, wodurch das Methodenspektrum über die traditionellen Techniken der Exposition von C. glabrata gegenüber Ethidiumbromid oder Fluconazol hinaus erweitert wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie enthüllt PDT als die erste berichtete Methode zur Induktion der Bildung kleiner Kolonien in Candida und übertrifft damit die etablierten Wirkungen von Ethidiumbromid und Fluconazol. Diese neuartige Beobachtung erfordert weitere Untersuchungen, um ihre Auswirkungen sowohl auf die Pilzausrottung durch Verringerung der Virulenz als auch auf das Auftreten von Resistenzmechanismen zu entschlüsseln.
Die RB-vermittelte PDT hemmt effektiv das Wachstum von C. glabrata, was auf …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], der National Cheng Kung University [K111-B094], [K111-B095], dem National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057] finanziert.
Materials
| 0.22 μm filter | Merck, Taipei, Taiwan | Millex, SLGVR33RS | |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745 | |
| 20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich, MO, USA | T8877 | |
| 5 mL polypropylene round bottom tube | Corning, AZ, USA | 352059 | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Corning, AZ, USA | Falcon, #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Agar | BRS, Tainan, Taiwan | AG012 | |
| Blank disk | Advantec, Tokyo, Japan | 49005040 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich, MO, USA | E1510 | |
| Fluconazole, 2 mg/mL | Pfizer, NY, USA | BC18790248 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 7.0 | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan | 5050 | Excitation wave: 500~550 nm |
| Low Temperature. shake Incubators | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Mouth care cotton swabs | Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan | 161357 | |
| Muller Hinton II agar | BD biosciences, California, USA | 211438 | |
| Multimode microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3x | |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei, Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
- Soriano, A., et al. Invasive candidiasis: current clinical challenges and unmet needs in adult populations. J Antimicrob Chemother. 78 (7), 1569-1585 (2023).
- Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nat Rev Dis Primers. 4, 18026 (2018).
- Meyahnwi, D., Siraw, B. B., Reingold, A. Epidemiologic features, clinical characteristics, and predictors of mortality in patients with candidemia in Alameda County, California; a 2017-2020 retrospective analysis. BMC Infect Dis. 22 (1), 843 (2022).
- Whittaker, P. A. The petite mutation in yeast. Subcell Biochem. 6, 175-232 (1979).
- Hatab, M. A., Whittaker, P. A. Isolation and characterization of respiration-deficient mutants from the pathogenic yeast Candida albicans. Antonie Van Leeuwenhoek. 61 (3), 207-219 (1992).
- Defontaine, A., et al. In-vitro resistance to azoles associated with mitochondrial DNA deficiency in Candida glabrata. J Med Microbiol. 48 (7), 663-670 (1999).
- Brun, S., et al. Relationships between respiration and susceptibility to azole antifungals in Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 47 (3), 847-853 (2003).
- Bouchara, J. P., et al. In-vivo selection of an azole-resistant petite mutant of Candida glabrata. J Med Microbiol. 49 (11), 977-984 (2000).
- Badrane, H., et al. Genotypic diversity and unrecognized antifungal resistance among populations of Candida glabrata from positive blood cultures. Nat Commun. 14 (1), 5918 (2023).
- Shantal, C. -. J. N., Juan, C. -. C., Lizbeth, B. -. U. S., Carlos, H. -. G. J., Estela, G. -. P. B. Candida glabrata is a successful pathogen: An artist manipulating the immune response. Microbiol Res. 260, 127038 (2022).
- Gamarra, S., Mancilla, E., Dudiuk, C., Garcia-Effron, G. Candida dubliniensis and Candida albicans differentiation by colony morphotype in Sabouraud-triphenyltetrazolium agar. Rev Iberoam Micol. 32 (2), 126-128 (2015).
- Hung, J. H., et al. Rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit Candida albicans. J Vis Exp. (181), e63558 (2022).
- Cardoso, D. R., Franco, D. W., Olsen, K., Andersen, M. L., Skibsted, L. H. Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis. J Agric Food Chem. 52 (21), 6602-6606 (2004).
- Hall, R. M., Trembath, M. K., Linnane, A. W., Wheelis, L., Criddle, R. S. Factors affecting petite induction and the recovery of respiratory competence in yeast cells exposed to ethidium bromide. Mol Gen Genet. 144 (3), 253-262 (1976).
- Chen, X. J., Clark-Walker, G. D. The petite mutation in yeasts: 50 years on. Int Rev Cytol. 194, 197-238 (2000).
- Piskur, J. Inheritance of the yeast mitochondrial genome. Plasmid. 31 (3), 229-241 (1994).
- Wong, T. W., Wang, Y. Y., Sheu, H. M., Chuang, Y. C. Bactericidal effects of toluidine blue-mediated photodynamic action on Vibrio vulnificus. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 895-902 (2005).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus drug resistance. J Clin Med. 8 (3), 411 (2019).
- Warrier, A., Mazumder, N., Prabhu, S., Satyamoorthy, K., Murali, T. S. Photodynamic therapy to control microbial biofilms. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102090 (2021).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
