Induzione di piccole colonie in Candida glabrato tramite terapia fotodinamica mediata dal Rose Bengala
Summary
Il significato delle piccole colonie nella resistenza ai farmaci di Candida spp. non è stato completamente esplorato. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) offre una strategia promettente contro le infezioni fungine resistenti ai farmaci. Questo studio dimostra che l’aPDT mediata dal bengala rosa disattiva efficacemente la Candida glabrata e induce piccole colonie, presentando una procedura unica.
Abstract
Di fronte a un tasso di mortalità del 40% nei pazienti con candidemia, la Candida resistente ai farmaci e i loro piccoli mutanti rimangono una delle principali sfide terapeutiche. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) prende di mira più strutture fungine, a differenza degli antibiotici/antimicotici, contrastando potenzialmente la resistenza. I metodi tradizionali per indurre piccole colonie si basano sul bromuro di etidio o sul fluconazolo, che possono influenzare la suscettibilità ai farmaci e le risposte allo stress. Questo studio ha studiato l’applicazione della luce verde (picco 520 nm) e del fotosensibilizzatore del bengala rosa (RB) per combattere un isolato di Candida glabrata resistente ai farmaci. I risultati hanno rivelato che il trattamento con aPDT ha inibito significativamente la crescita cellulare (riduzione del ≥99,9%) e ha indotto efficacemente la formazione di colonie piccole, come evidenziato dalle dimensioni ridotte e dalla perdita della colorazione dell’indicatore redox mitocondriale. Questo studio fornisce la prova iniziale che l’aPDT può indurre colonie piccole in un ceppo di C. glabrata multiresistente in vitro, offrendo un approccio potenzialmente trasformativo per combattere le infezioni fungine resistenti.
Introduction
Le infezioni fungine, in particolare quelle causate dalla Candida albicans e dalla Candida glabrata, sempre più resistente ai farmaci, rappresentano una seria minaccia globale1. Queste infezioni possono essere mortali, specialmente per i pazienti ospedalizzati e quelli con un sistema immunitario indebolito. L’aumento della resistenza antifungina minaccia il controllo della candidosi invasiva, una grave infezione fungina con elevata mortalità, in particolare da Candida albicans2. I ceppi resistenti ostacolano un trattamento efficace, aumentando potenzialmente sia la complessità che i tassi di mortalità. Nella contea di Alameda, California, USA, C. glabrata è diventata la specie invasiva più diffusa3. Questo cambiamento nella prevalenza e nella distribuzione delle specie di Candida può essere influenzato dalle pratiche sanitarie locali, dai dati demografici dei pazienti, dall’utilizzo di agenti antifungini e dalla prevalenza dei fattori di rischio per le infezioni da Candida.
Piccoli mutanti nella Candida, privi di mitocondri funzionali, rivelano come questo organello influenzi la risposta ai farmaci, la virulenza e la resistenza allo stress 4,5. C. glabrata forma facilmente queste colonie, acquisendo sensibilità ai polieni mentre la perde a favore degli azoli6. La sensibilità azolica e la funzione respiratoria sono strettamente collegate, con una diminuzione della respirazione che porta alla resistenza attraverso la perdita di DNA mitocondriale7. Piccole colonie di C. glabrata con resistenza all’azolo sono state isolate da campioni di feci umane da un ricevente di trapianto di midollo osseo sottoposto a trattamento con fluconazolo8 e da flaconi di emocoltura di pazienti con infezioni del flusso sanguigno9. Le loro potenziali implicazioni nella resistenza ai farmaci, nella virulenza e nella risposta allo stress evidenziano il loro significato clinico. Inoltre, le loro proprietà distinte li rendono strumenti preziosi per indagare su questioni fondamentali nella biologia mitocondriale5. Man mano che la ricerca sui mutanti petite continua, è probabile che le loro applicazioni nella ricerca clinica e di base si espandano.
Questo studio ha scoperto che la terapia fotodinamica (PDT) può indurre piccole colonie in C. glabrata, ampliando la gamma di metodi oltre le tecniche tradizionali di esposizione di C. glabrata al bromuro di etidio o al fluconazolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio rivela la PDT come il primo metodo riportato per indurre la formazione di piccole colonie nella Candida, superando gli effetti stabiliti del bromuro di etidio e del fluconazolo. Questa nuova osservazione richiede ulteriori esplorazioni per svelare le sue implicazioni sia per l’eradicazione fungina diminuendo la virulenza che per l’emergere di meccanismi di resistenza.
La PDT mediata da RB inibisce efficacemente la crescita di C. glabrata, suggerendo un potenziale approcc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], National Cheng Kung University [K111-B094], [K111-B095], National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057].
Materials
| 0.22 μm filter | Merck, Taipei, Taiwan | Millex, SLGVR33RS | |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745 | |
| 20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich, MO, USA | T8877 | |
| 5 mL polypropylene round bottom tube | Corning, AZ, USA | 352059 | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Corning, AZ, USA | Falcon, #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Agar | BRS, Tainan, Taiwan | AG012 | |
| Blank disk | Advantec, Tokyo, Japan | 49005040 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich, MO, USA | E1510 | |
| Fluconazole, 2 mg/mL | Pfizer, NY, USA | BC18790248 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 7.0 | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan | 5050 | Excitation wave: 500~550 nm |
| Low Temperature. shake Incubators | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Mouth care cotton swabs | Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan | 161357 | |
| Muller Hinton II agar | BD biosciences, California, USA | 211438 | |
| Multimode microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3x | |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei, Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
- Soriano, A., et al. Invasive candidiasis: current clinical challenges and unmet needs in adult populations. J Antimicrob Chemother. 78 (7), 1569-1585 (2023).
- Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nat Rev Dis Primers. 4, 18026 (2018).
- Meyahnwi, D., Siraw, B. B., Reingold, A. Epidemiologic features, clinical characteristics, and predictors of mortality in patients with candidemia in Alameda County, California; a 2017-2020 retrospective analysis. BMC Infect Dis. 22 (1), 843 (2022).
- Whittaker, P. A. The petite mutation in yeast. Subcell Biochem. 6, 175-232 (1979).
- Hatab, M. A., Whittaker, P. A. Isolation and characterization of respiration-deficient mutants from the pathogenic yeast Candida albicans. Antonie Van Leeuwenhoek. 61 (3), 207-219 (1992).
- Defontaine, A., et al. In-vitro resistance to azoles associated with mitochondrial DNA deficiency in Candida glabrata. J Med Microbiol. 48 (7), 663-670 (1999).
- Brun, S., et al. Relationships between respiration and susceptibility to azole antifungals in Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 47 (3), 847-853 (2003).
- Bouchara, J. P., et al. In-vivo selection of an azole-resistant petite mutant of Candida glabrata. J Med Microbiol. 49 (11), 977-984 (2000).
- Badrane, H., et al. Genotypic diversity and unrecognized antifungal resistance among populations of Candida glabrata from positive blood cultures. Nat Commun. 14 (1), 5918 (2023).
- Shantal, C. -. J. N., Juan, C. -. C., Lizbeth, B. -. U. S., Carlos, H. -. G. J., Estela, G. -. P. B. Candida glabrata is a successful pathogen: An artist manipulating the immune response. Microbiol Res. 260, 127038 (2022).
- Gamarra, S., Mancilla, E., Dudiuk, C., Garcia-Effron, G. Candida dubliniensis and Candida albicans differentiation by colony morphotype in Sabouraud-triphenyltetrazolium agar. Rev Iberoam Micol. 32 (2), 126-128 (2015).
- Hung, J. H., et al. Rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit Candida albicans. J Vis Exp. (181), e63558 (2022).
- Cardoso, D. R., Franco, D. W., Olsen, K., Andersen, M. L., Skibsted, L. H. Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis. J Agric Food Chem. 52 (21), 6602-6606 (2004).
- Hall, R. M., Trembath, M. K., Linnane, A. W., Wheelis, L., Criddle, R. S. Factors affecting petite induction and the recovery of respiratory competence in yeast cells exposed to ethidium bromide. Mol Gen Genet. 144 (3), 253-262 (1976).
- Chen, X. J., Clark-Walker, G. D. The petite mutation in yeasts: 50 years on. Int Rev Cytol. 194, 197-238 (2000).
- Piskur, J. Inheritance of the yeast mitochondrial genome. Plasmid. 31 (3), 229-241 (1994).
- Wong, T. W., Wang, Y. Y., Sheu, H. M., Chuang, Y. C. Bactericidal effects of toluidine blue-mediated photodynamic action on Vibrio vulnificus. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 895-902 (2005).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus drug resistance. J Clin Med. 8 (3), 411 (2019).
- Warrier, A., Mazumder, N., Prabhu, S., Satyamoorthy, K., Murali, T. S. Photodynamic therapy to control microbial biofilms. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102090 (2021).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
