Трехмерная клеточная культура стволовых клеток жировой ткани в гидрогеле с фотобиомодуляционной аугментацией

Summary

Здесь мы представляем протокол, демонстрирующий использование гидрогеля в качестве трехмерного (3D) каркаса клеточной культуры для культивирования стволовых клеток жировой ткани (ADSC) и внедрение фотобиомодуляции (PBM) для усиления пролиферации ADSC в условиях 3D-культуры.

Abstract

Стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ADSC), обладающие мультипотентными мезенхимальными характеристиками, близкими к стволовым клеткам, часто используются в регенеративной медицине из-за их способности к разнообразному диапазону клеточной дифференцировки и их способности усиливать миграцию, пролиферацию и смягчать воспаление. Тем не менее, ADSC часто сталкиваются с проблемами выживания и приживления в ранах, в первую очередь из-за неблагоприятных воспалительных условий. Для решения этой проблемы были разработаны гидрогели для поддержания жизнеспособности ADSC в ранах и ускорения процесса заживления ран. В данной работе мы поставили перед собой цель оценить синергетическое влияние фотобиомодуляции (ФБМ) на пролиферацию и цитотоксичность ADSC в рамках 3D-клеточной культуры. Иммортализированные АЦП высевали в гидрогели по 10 мкл плотностью 2,5 х 10³ клетки и подвергали облучению с использованием диодов 525 нм и 825 нм при флюенциях 5 Дж/^см2 и 10 Дж/^см2. Морфологические изменения, цитотоксичность и пролиферацию оценивали через 24 ч и 10 дней после воздействия ПБМ. ADSC имели округлую морфологию и были рассеяны по всему гелю в виде отдельных клеток или сфероидных агрегатов. Важно отметить, что как PBM, так и 3D-культуральный каркас не оказывали цитотоксического воздействия на клетки, в то время как PBM значительно увеличивал скорость пролиферации ADSC. В заключение, это исследование демонстрирует использование гидрогеля в качестве подходящей 3D-среды для культуры ADSC и представляет PBM в качестве важной стратегии аугментации, в частности, для решения проблемы медленной скорости пролиферации, связанной с 3D-культурой клеток.

Introduction

ADSC представляют собой мезенхимальные мультипотентные клетки-предшественники, обладающие способностью к самообновлению и дифференцировке в несколько клеточных линий. Эти клетки могут быть получены из стромально-васкулярной фракции (SVF) жировой ткани во время процедуры липоаспирации¹. ADSC стали идеальным типом стволовых клеток для использования в регенеративной медицине, потому что эти клетки многочисленны, минимально инвазивны для сбора, легко доступны и хорошо охарактеризованы². Терапия стволовыми клетками предлагает возможный путь к заживлению ран путем стимуляции миграции клеток, пролиферации, неоваскуляризации и уменьшения воспаления в ранах ^3,4. Примерно 80% регенеративной способности ADSC связано с паракринной сигнализацией через их секретом⁵. Ранее предполагалось, что прямая местная инъекция стволовых клеток или факторов роста в поврежденную ткань может привести к возникновению достаточных механизмов репарации in vivo ^6,7,8. Однако этот подход столкнулся с рядом проблем, таких как низкая выживаемость и снижение приживления стволовых клеток в поврежденных тканях в результате воспалительной среды ⁹. Кроме того, одной из названных причин было отсутствие внеклеточного матрикса для поддержки выживания и функциональности трансплантированных^{клеток.} Для преодоления этих проблем в настоящее время особое внимание уделяется разработке носителей биоматериала для поддержания жизнеспособности и функционирования стволовых клеток.

Трехмерная (3D) клеточная культура усиливает межклеточное и межматричное взаимодействие in vitro, обеспечивая среду, которая лучше напоминает среду in vivo ¹¹. Гидрогели были широко изучены как класс носителей биоматериала, которые обеспечивают 3D-среду для культуры стволовых клеток. Эти структуры состоят из воды и сшитых полимеров¹². Инкапсуляция АДСК в гидрогель практически не оказывает цитотоксического действия на клетки в процессе культивирования при сохранении жизнеспособности клеток⁶. Стволовые клетки, культивируемые в 3D, демонстрируют улучшенное сохранение своей стволовой способности и улучшенную способность к дифференцировке¹³. Аналогичным образом, засеянные гидрогелем ADSC продемонстрировали повышенную жизнеспособность и ускоренное закрытие ран на животных моделях¹⁴. Кроме того, гидрогелевая инкапсуляция значительно увеличивает приживление и удержание ADSC в ранах^15,16. TrueGel3D изготавливается из полимера, поливинилового спирта или декстрана, затвердевающего сшивающим агентом, циклодекстрином или полиэтиленгликолем¹⁷. Гель представляет собой синтетический гидрогель, который не содержит каких-либо продуктов животного происхождения, которые могут помешать экспериментам или вызвать иммунную реакцию во время трансплантации геля пациенту, эффективно имитируя внеклеточный матрикс¹⁸. Гель полностью настраивается путем изменения состава и отдельных компонентов. Он может содержать различные стволовые клетки и поддерживать дифференцировку нескольких типов клеток, регулируя жесткость геля¹⁹. Сайты прикрепления могут быть созданы путем добавления пептидов²⁰. Гель расщепляется за счет секреции металлопротеаз, что позволяет осуществлять миграцию клеток²¹. Наконец, он понятен и позволяет использовать методы визуализации.

ПБМ – это минимально инвазивная и легко выполняемая форма низкоуровневой лазерной терапии, используемая для стимуляции внутриклеточных хромофоров. Различные длины волн вызывают различное воздействие на клетки²². Свет в диапазоне от красного до ближнего инфракрасного стимулирует повышенную продукцию аденозинтрифосфата (АТФ) и активных форм кислорода (АФК) за счет усиления потока через цепь переноса электронов²³. Свет в синем и зеленом диапазонах стимулирует светозависимые ионные каналы, обеспечивая неспецифический приток катионов, таких как кальций и магний, в клетки, что, как известно, усиливает дифференцировку^. Конечным эффектом является генерация вторичных мессенджеров, которые стимулируют транскрипцию факторов, запускающих последующие клеточные процессы, такие как миграция, пролиферация и дифференцировка. PBM может быть использован для предварительной подготовки клеток к пролиферации или дифференцировке перед трансплантацией клеток в неблагоприятную среду, например, в поврежденную ткань²⁶. До и после трансплантации ПБМ (630 нм и 810 нм) воздействие ADSC значительно повышало жизнеспособность и функцию этих клеток in vivo у крыс с диабетом модели²⁷. Регенеративная медицина требует достаточного количества клеток для эффективного восстановления тканей²⁸. В 3D-культуре клеток ADSC ассоциировались с более медленными темпами пролиферации по сравнению с двумерными клеточными культурами⁶. Тем не менее, PBM может быть использован для расширения процесса 3D-культивирования клеток ADSC за счет повышения жизнеспособности, пролиферации, миграции и дифференцировки^29,30.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, реагентам и программному обеспечению, используемым в этом протоколе. Протокол графически представлен на рисунке 1. 1. Двумерная (2D) клеточна…

Representative Results

Для оценки морфологии и визуального осмотра плотности клеток гидрогелей использовали обратную микроскопию (рис. 2). ADSC сохраняли округлую морфологию через 24 ч после посева и воздействия PBM. Клетки были разбросаны по всему гелю в виде одиночных клеток или в виноградоподо?…

Discussion

ADSC являются идеальным типом клеток для использования в регенеративной медицине, поскольку они стимулируют различные процессы, способствуя заживлению ран ^3,4. Тем не менее, существует ряд проблем, которые необходимо обойти, например, низкая выживаемость и…

Materials

525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher – Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader