Denne artikkelen beskriver en protokoll for aggregering og innkapsling av miltceller i en halvfast kjellermembranmatrise. Kjellermembranmatrisekonstruksjoner kan brukes i tredimensjonal kultur for å studere organoidutvikling, eller for in vivo transplantasjon og vevregenereringsstudier.
Milten er et immunorgan som spiller en nøkkelrolle i blodbårne immunresponser. Det anatomiske eller funksjonelle tapet av dette vevet øker følsomheten for alvorlige blodinfeksjoner og sepsis. Autotransplantasjon av miltskiver har blitt brukt klinisk for å erstatte tapt vev og gjenopprette immunfunksjonen. Mekanismen som driver robust og immunologisk funksjonell regenerering av miltvev er imidlertid ikke fullstendig klarlagt. Her tar vi sikte på å utvikle en metode for å aggregere og innkapsle miltceller i en halvfast matrise for å undersøke cellekravene for miltvevsdannelse. Kjellermembranmatriseinnkapslede cellekonstruksjoner er egnet til både in vitro vevskultur av tredimensjonale organoider samt transplantasjon under nyrekapselen for direkte å vurdere in vivo vevsdannelse. Ved å manipulere inngangscellene for aggregering og innkapsling, demonstrerer vi at transplantatavledede PDGFRβ + MAdCAM-1– neonatale stromale celler er nødvendige for miltvevregenerering under dyretransplantasjonsmodeller.
Traumatisk ruptur av milten og utseendet på flere miltknuter i kroppen var en av de første indikasjonene på at miltvev hadde regenerativ kapasitet 1,2. Milttransplantasjoner ble senere introdusert i klinikken for å bevare miltvev hos pasienter som trengte akutt splenektomi3. Likevel, til tross for å være en del av klinisk praksis i flere tiår, er svært lite kjent om hvordan milten regenererer. Dyretransplantasjonsmodeller har gitt innsikt i flere parametere for miltregenerering og immunfunksjon 4,5. Spesielt har eksperimentelle modifikasjoner av transplantatprepareringsmetoden gjort det mulig å studere vevregenerering i større detalj på cellulært og molekylært nivå.
Transplantasjoner med hele miltskiver gjennomgår en fase med massenekrose før en ny miltstruktur gjenoppbygges6. Den innledende fasen av transplantatnekrose antyder at hoveddelen av transplantert vev i stor grad består av røde og hvite blodlegemer og er unødvendig for miltregenerering. Dette ble undersøkt eksperimentelt ved å ekskludere hematopoietiske celler fra milttransplantater før transplantasjon under nyrekapselen mus. Her ble ikke-leukocytt/ikke-erytrocyttfraksjonen av milten, som inkluderer stromale og endotelceller, vist å være tilstrekkelig til å indusere de novo vevsdannelse7. Miltstromalvev kan videre behandles til en enkeltcellesuspensjon, noe som muliggjør bruk av cellesorteringsteknologier for å manipulere cellulær transplantatsammensetning. Ved selektivt å fjerne kandidatcelletyper ble det identifisert to CD45-TER-119-stromale cellepopulasjoner som var uunnværlige for transplantatutvikling: en endotellignende CD31+CD105+MAdCAM-1+ cellepopulasjon og en bredere definert PDGFRβ+ mesenkymal cellepopulasjon8.
Konstruksjonen av transplantater fra miltceller varierer når det gjelder støttemateriell og cellebelastningsprosesser. Vevskonstruerte milter har tidligere blitt fremstilt ved å legge miltenheter på et polyglykolsyre/poly-L melkesyrepolymerstillas 5,9. Interessant, milt stromale celler absorbert i en kollagen svamp klarte ikke å engraft, mens stromale celler aggregert og lastet over et kollagenark lettet milt regenerering8. Resuspensjonen av stromale miltceller inne i en Matrigel-matriks har også vist seg å indusere celleaggregering under tredimensjonale kulturbetingelser10. Denne metoden er imidlertid ikke testet for bruk i transplantasjonsmodeller. Det overordnede målet med dagens protokoll er å tvangsaggregere og innkapsle stromale celler i milten direkte i kjellermembranmatrisen, som deretter kan overføres til et tredimensjonalt in vitro vevskultursystem eller brukes som et kjøretøy for dyremodelltransplantasjoner (tilleggsfigur 1).
Aggregeringen av neonatale miltceller inne i et halvfast medium representerer en levedyktig metode for å generere miltkonstruksjoner. Lignende kjellermembranmatrisebaserte protokoller har blitt brukt til å initiere tredimensjonale miltkulturer10. Her demonstrerer vi at miltkonstruksjoner er like mottagelige for in vitro organoide dyrkningssystemer så vel som in vivo transplantasjonsmodeller. Det er verdt å merke seg at transplantasjon av in vitro-dyrkede miltorganoid…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av National Health and Medical Research Council of Australia (#GNT1078247).
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes | Corning | CLS4401 | For placing inside a 14 ml conical tube |
B-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Stock 55 mM, use at 50 uM |
Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | From Clostridium histolyticum |
Deoxyribonuclease I (DNase I) | Sigma-Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered. |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered |
Eclipse 200 μl Pipette Tips | Labcon | 1030-260-000 | Bevel Point |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | Lot# 1382243 |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Stock 100X, use at 1X |
Matrigel | Corning | 354263 | Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186 |
MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140076 | Stock 100X, use at 1X |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin |
Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27216 | 70 μm |
Ring Tweezers | NAPOX | A-26 | Ring size: 3 mm |
Rock Inhibitor (Y-27632) | MedChemExpres | HY-10071 | |
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge | Thermofisher | Acceleration and deceleration speeds were set to 8 | |
Ultra Fine Tweezers | EMS | 78340-51S | Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish. |
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel | Ethicon | J283G | |
Wiretrol II Long Wire Plunger | Drummond | 5-000-2002-L | Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long |
Wound Clip Applier | MikRon | 427630 | |
Wound Clips | MikRon | 427631 | 9 mm |