Den här artikeln beskriver ett protokoll för att aggregera och kapsla in mjältceller i en halvfast basalmembranmatris. Basalmembranmatriskonstruktioner kan användas i tredimensionell odling för att studera organoidutveckling, eller för in vivo-transplantation och vävnadsregenereringsstudier.
Mjälten är ett immunorgan som spelar en nyckelroll i blodburna immunsvar. Den anatomiska eller funktionella förlusten av denna vävnad ökar mottagligheten för allvarliga blodinfektioner och sepsis. Autotransplantation av mjältskivor har använts kliniskt för att ersätta förlorad vävnad och återställa immunfunktionen. Mekanismen som driver robust och immunologiskt funktionell mjältvävnadsregenerering har dock inte klarlagts helt. Här strävar vi efter att utveckla en metod för att aggregera och kapsla in mjältceller i en halvfast matris för att undersöka de cellulära kraven för mjältvävnadsbildning. Basalmembranmatrisinkapslade cellkonstruktioner är mottagliga för både de vitro-vävnadsodling av tredimensionella organoider samt transplantation under njurkapseln för att direkt bedöma vävnadsbildning in vivo. Genom att manipulera ingångscellerna för aggregering och inkapsling visar vi att transplantat-härledda PDGFRβ+MAdCAM-1-neonatala stromaceller krävs för regenerering av mjältvävnad under djurtransplantationsmodeller.
Traumatisk bristning av mjälten och uppkomsten av flera mjältknölar i kroppen var en av de första indikationerna på att mjältvävnad hade regenerativ kapacitet 1,2. Autotransplantationer av mjälte introducerades senare i kliniken för att bevara mjältvävnad hos patienter som behövde akut splenektomi3. Men trots att det har varit en del av klinisk praxis i årtionden är mycket lite känt om hur mjälten regenererar. Djurtransplantationsmodeller har gett insikt i flera parametrar för mjältregenerering och immunfunktion 4,5. I synnerhet har experimentella modifieringar av graftberedningsmetoden gjort det möjligt att studera vävnadsregenerering mer i detalj på cellulär och molekylär nivå.
Transplantationer som involverar hela mjältskivor genomgår en fas av massnekros innan en ny mjältstrukturåteruppbyggs. Den inledande fasen av transplantatnekros tyder på att huvuddelen av transplanterad vävnad till stor del består av röda och vita blodkroppar och är onödig för mjältregenerering. Detta undersöktes experimentellt genom att utesluta hematopoetiska celler från mjälttransplantat före transplantation under musens njurkapsel. Här visade sig den icke-leukocyt/icke-erytrocytfraktionen i mjälten, som inkluderar stroma- och endotelceller, vara tillräcklig för att inducera de novo-vävnadsbildning 7. Mjältens stromavävnad kan bearbetas vidare till en encellssuspension, vilket möjliggör användning av cellsorteringsteknik för att manipulera cellulära transplantatkompositioner. Genom att selektivt ta bort kandidatcelltyper identifierades två CD45-TER-119-stromacellspopulationer som var oumbärliga för transplantatutveckling: en endotelliknande CD31+CD105+MAdCAM-1+-cellpopulation och en mer brett definierad PDGFRβ+ mesenkymal cellpopulation8.
Uppbyggnaden av transplantat från mjältceller varierar när det gäller stödmaterial och cellladdningsprocesser. Vävnadskonstruerad mjälte har tidigare framställts genom att ladda mjältenheter på en polyglykolsyra/poly-L mjölksyrapolymerställning 5,9. Intressant nog misslyckades mjältens stromaceller absorberade i en kollagensvamp med att transplantera, medan stromaceller aggregerade och laddade över ett kollagenark underlättade mjältens regenerering8. Resuspensionen av mjältens stromaceller inuti en Matrigel-matris har också visat sig inducera cellaggregering under tredimensionella odlingsförhållanden10. Denna metod har dock inte testats för användning i transplantationsmodeller. Det övergripande målet med det nuvarande protokollet är att med tvång aggregera och kapsla in mjältstromaceller direkt i basalmembranmatrisen, som därefter kan överföras till ett tredimensionellt de vitro-vävnadsodlingssystem eller användas som ett fordon för djurmodelltransplantationer (tilläggsfigur 1).
Aggregeringen av neonatala mjältceller inuti ett halvfast medium representerar en gångbar metod för att generera mjältkonstruktioner. Liknande basalmembranmatrisbaserade protokoll har använts för att initiera tredimensionella mjältkulturer10. Här visar vi att mjältkonstrukt är lika mottagliga för in vitro organoidodlingssystem som för in vivo transplantationsmodeller. Värt att notera är att transplantation av in vitro-odlade mjältorganoider ännu inte har …
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av National Health and Medical Research Council of Australia (#GNT1078247).
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes | Corning | CLS4401 | For placing inside a 14 ml conical tube |
B-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Stock 55 mM, use at 50 uM |
Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | From Clostridium histolyticum |
Deoxyribonuclease I (DNase I) | Sigma-Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered. |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered |
Eclipse 200 μl Pipette Tips | Labcon | 1030-260-000 | Bevel Point |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | Lot# 1382243 |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Stock 100X, use at 1X |
Matrigel | Corning | 354263 | Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186 |
MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140076 | Stock 100X, use at 1X |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin |
Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27216 | 70 μm |
Ring Tweezers | NAPOX | A-26 | Ring size: 3 mm |
Rock Inhibitor (Y-27632) | MedChemExpres | HY-10071 | |
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge | Thermofisher | Acceleration and deceleration speeds were set to 8 | |
Ultra Fine Tweezers | EMS | 78340-51S | Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish. |
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel | Ethicon | J283G | |
Wiretrol II Long Wire Plunger | Drummond | 5-000-2002-L | Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long |
Wound Clip Applier | MikRon | 427630 | |
Wound Clips | MikRon | 427631 | 9 mm |