Lysarkavbildning for å avsløre hjertestruktur i gnagerhjerter
Summary
Protokollen benytter avansert lysarkmikroskopi sammen med tilpassede vevsryddingsmetoder for å undersøke intrikate hjertestrukturer i gnagerhjerter, med stort potensial for forståelse av hjertemorfogenese og remodellering.
Abstract
Lysarkmikroskopi (LSM) spiller en sentral rolle i å forstå den intrikate tredimensjonale (3D) strukturen i hjertet, og gir avgjørende innsikt i grunnleggende hjertefysiologi og patologiske responser. Vi dykker herved inn i utviklingen og implementeringen av LSM-teknikken for å belyse hjertets mikroarkitektur i musemodeller. Metodikken integrerer et tilpasset LSM-system med vevsryddingsteknikker, og reduserer lysspredning i hjertevev for volumetrisk avbildning. Kombinasjonen av konvensjonell LSM med bildesøm og multiview deconvolution tilnærminger gjør det mulig å fange hele hjertet. For å adressere den iboende avveiningen mellom aksial oppløsning og synsfelt (FOV), introduserer vi videre en aksialt feid lysarkmikroskopi (ASLM) -metode for å minimere ufokusert lys og jevnt belyse hjertet over forplantningsretningen. I mellomtiden forbedrer vevsryddingsmetoder som iDISCO lyspenetrasjon, letter visualiseringen av dype strukturer og sikrer en omfattende undersøkelse av myokardiet gjennom hele hjertet. Kombinasjonen av de foreslåtte LSM- og vevsryddingsmetodene presenterer en lovende plattform for forskere i å løse hjertestrukturer i gnagerhjerter, og har stort potensial for forståelse av hjertemorfogenese og remodellering.
Introduction
Hjertesvikt er fortsatt den ledende årsaken til dødelighet over hele verden, hovedsakelig på grunn av mangel på regenerativ kapasitet av modne kardiomyocytter1. Den intrikate arkitekturen i hjertet spiller en avgjørende rolle i sin funksjon og gir innsikt i utviklingsprosesser. En dyp forståelse av hjertestruktur er avgjørende for å belyse de grunnleggende prosessene for hjertemorfogenese og remodellering som respons på hjerteinfarkt. Nylige fremskritt har vist at nyfødte mus kan gjenopprette hjertefunksjonen etter skade, mens voksne mus mangler slik regenerativ kapasitet2. Dette etablerer et grunnlag for å undersøke signaler knyttet til strukturelle og funksjonelle abnormiteter i musemodeller. Tradisjonelle bildebehandlingsmetoder, som konfokalmikroskopi, har tekniske begrensninger, inkludert begrenset penetrasjonsdybde, langsom punktskanning og fotoskade fra langvarig eksponering for laserlys. Disse hindrer omfattende tredimensjonal (3D) avbildning av det intakte hjertet. I denne sammenheng fremstår lysarkmikroskopi (LSM) som en kraftig løsning, og tilbyr fordelene med høyhastighetsbilder, redusert fotoskade og eksepsjonelle optiske seksjoneringsevner 3,4,5. De unike egenskapene til LSM posisjonerer det som en lovende metode for å overvinne begrensningene i konvensjonelle teknikker, og gir enestående innsikt i hjerteutvikling og ombyggingsprosesser 6,7,8.
I denne protokollen introduserer vi en avbildningsstrategi som kombinerer avansert LSM med tilpassede vevsryddingsmetoder9, noe som muliggjør avbildning av hele musehjerter uten behov for spesifikk merking og mekanisk seksjonering. Vi foreslår videre at konvensjonell LSM-avbildning kan forbedres gjennom multiview deconvolution10 eller aksialt feid lysarkmikroskopi (ASLM) teknikker 11,12,13,14,15 for å forbedre aksial oppløsning. I tillegg kan integrering av bildesøm med en av disse metodene effektivt overvinne avveiningen mellom romlig oppløsning og synsfelt (FOV), og dermed fremme avbildningen av voksne musehjerter. Inkorporering av mange vevsryddingsmetoder, inkludert hydrofobe, hydrofile og hydrogelbaserte metoder, muliggjør dypere lyspenetrasjon for å fange morfologien til hele hjertet 16,17,18,19.
Mens flere ryddemetoder er kompatible med dagens LSM-systemer, er målet å minimere fotonspredning og forbedre lyspenetrasjonen i vev, som hjertet, ved å erstatte lipider med et medium som nøye samsvarer med brytningsindeksen. iDISCO ble valgt som representant20,21 og tilpasset autofluorescensavbildning i denne protokollen på grunn av rask behandling og høy gjennomsiktighet (figur 1A). Samlet gir integreringen av den avanserte LSM-tilnærmingen med vevsryddingsteknikker et lovende rammeverk for å avdekke intrikat hjerteanatomi i gnagerhjerter, og har et betydelig potensial for å fremme vår forståelse av hjertemorfogenese og patogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utviklingen av bildebehandling, beregning og vevsryddingsmetoder har gitt en enestående mulighet til å undersøke hjertestruktur og funksjon i stor grad. Dette har et stort potensial for å utdype vår forståelse av hjertemorfogenese og patogenese ved hjelp av en intakt gnagerhjertemodell. I motsetning til in vivo-studier av sebrafiskhjerte med en lignende tilnærming 40,41,42,43, gjør integreringen av avanserte LSM-teknikker og vevsryddingsmetoder oss i stand til å overvinne utfordringer mellom romlig oppl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uttrykker vår takknemlighet til Dr. Eric Olsons gruppe ved UT Southwestern Medical Center for sjenerøst å dele dyremodellene. Vi setter pris på alle konstruktive kommentarer fra D-inkubator medlemmer på UT Dallas. Dette arbeidet ble støttet av NIH R00HL148493 (YD), R01HL162635 (YD) og UT Dallas STARS-programmet (YD).
Materials
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | – | – | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
References
- Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Stelzer, E. H. K. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Prim. 1, 73 (2021).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J Opt. 20, 053002 (2018).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396 (2018).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209 (2017).
- Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
- Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
- Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
- Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924 (2018).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
- Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795 (2021).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278 (2023).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nat Rev Methods Prim. 1, 1-24 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
- Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821 (2020).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
- Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149 (2014).
- Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
- Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
- Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
- Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
- Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387 (2021).
- Sands, G. B., et al. It’s clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
- Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol – Hear Circ Physiol. 323, H257 (2022).
- Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
- Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
- Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112 (2023).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263 (2024).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807 (2021).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271 (2018).
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat Rev Methods Prim. 3, 1-1 (2023).
- Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
- Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678 (2017).
- Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101 (2019).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072 (2017).
- Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36 (2015).
