Quantification du niveau de 8-oxo-dG à l’aide d’un test ELISA pour évaluer les dommages oxydatifs à l’ADN dans les cellules MCF-7

Summary

Ce protocole décrit une méthode efficace pour détecter quantitativement les dommages oxydatifs de l’ADN dans les cellules MCF-7 par la technologie ELISA.

Abstract

La base 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dG) est la forme prédominante de dommages oxydatifs de l’ADN couramment observés. L’altération de l’ADN a un impact profond sur l’expression des gènes et sert de facteur pivot dans la stimulation des troubles neurodégénératifs, du cancer et du vieillissement. Par conséquent, la quantification précise du 8-oxoG a une importance clinique dans l’étude des méthodologies de détection des dommages à l’ADN. Cependant, à l’heure actuelle, les approches existantes pour la détection du 8-oxoG posent des défis en termes de commodité, de rapidité, d’abordabilité et de sensibilité accrue. Nous avons utilisé la technique ELISA (Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent assay), une méthode colorimétrique très efficace et rapide, pour détecter les variations de la teneur en 8-oxo-dG dans des échantillons de cellules MCF-7 stimulés avec différentes concentrations de peroxyde d’hydrogène (H₂O₂). Nous avons déterminé la concentration de H₂O₂ qui a induit des dommages oxydatifs dans les cellules MCF-7 en détectant sa valeur IC₅₀ dans les cellules MCF-7. Par la suite, nous avons traité des cellules MCF-7 avec 0, 0,25 et 0,75 mM H₂O₂ pendant 12 h et extrait le 8-oxo-dG des cellules. Enfin, les échantillons ont été soumis à l’ELISA. Après une série d’étapes, y compris l’étalement de la plaque, le lavage, l’incubation, le développement de la couleur, la fin de la réaction et la collecte de données, nous avons réussi à détecter des changements dans la teneur en 8-oxo-dG dans les cellules MCF-7 induits par H₂O₂. Grâce à de tels efforts, nous visons à établir une méthode pour évaluer le degré de dommages oxydatifs de l’ADN dans les échantillons cellulaires et, ce faisant, à faire progresser le développement d’approches plus rapides et plus pratiques pour la détection des dommages à l’ADN. Cette entreprise est sur le point d’apporter une contribution significative à l’exploration des analyses associatives entre les dommages oxydatifs de l’ADN et divers domaines, y compris la recherche clinique sur les maladies et la détection de substances toxiques.

Introduction

Les dommages oxydatifs de l’ADN sont la conséquence d’un déséquilibre entre la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et le système de défense antioxydant^{cellulaire 1}. Il s’agit principalement de l’oxydation de l’ADN, des bases^purine et pyrimidine ^2,3. Cette modification oxydative des bases de l’ADN compromet non seulement l’intégrité du génome, mais englobe également un large éventail de problèmes pathologiques, notamment le cancer, les maladies neurodégénératives et les maladies cardiovasculaires ^4,5. La base guanine de l’ADN a le potentiel de réduction le plus faible et est la plus sensible à l’oxydation⁶. Par conséquent, la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dG) sert de marqueur primaire pour évaluer l’étendue des dommages oxydatifs de l’ADN ^7,8. La quantification précise du 8-oxo-dG est devenue un problème critique pour aborder divers aspects de l’apparition et de la progression de la maladie et de l’évaluation de la charge oxydative multifactorielle⁹.

Les méthodes traditionnelles de détection du 8-oxo-dG, telles que la chromatographie liquide à haute performance avec détection électrochimique (HPLC-ECD), la spectrométrie de masse et les techniques associées avec trait d’union, présentent une sensibilité et une spécificité élevées 10,11,12. Cependant, ces techniques ont souvent des exigences opérationnelles complexes et des coûts élevés, ce qui entrave leur applicabilité généralisée et leur praticité dans l’analyse d’échantillons à haut débit. Avec les progrès continus de la science et de la technologie, une variété de nouvelles méthodes efficaces et précises ont émergé. L’application de ces nouvelles technologies nous permet de quantifier plus précisément le niveau de 8-oxo-dG et fournit des outils plus puissants pour une étude approfondie de l’association entre le stress oxydatif et la maladie. Par exemple, les chercheurs ont appliqué la technologie des nanopores pour détecter et séquencer quantitativement l’ADN¹³, identifier les types de dommages à l’ADN à l’aide d’une stratégie de séquençage de code en un seul clic¹⁴, développer des méthodes de séquençage à haut débit et créer des biocapteurs basés sur le 8-oxoG en intégrant la biotine-streptavidine à ELISA¹⁵. Parmi elles, l’ELISA, avec ses avantages reconnus en termes de spécificité, de criblage à haut débit et de coût, est l’une des solutions idéales pour la détection 8-oxo-dG. Par conséquent, il est crucial de développer une méthode à haut débit, très sensible, pratique et rapide pour détecter le 8-oxo-dG.

La technique ELISA (enzyme-related immunosorbent assay), développée en 1971¹⁶, a rapidement progressé au cours des 50 dernières années et est maintenant devenue l’une des méthodes de détection les plus couramment utilisées dans les domaines de la biologie et de la médecine 17,18,19. La technologie ELISA présente une sensibilité et une spécificité élevées, possède un temps de réaction court et est facile à utiliser, ce qui en fait un choix largement reconnu pour les tests d’échantillons à grande échelle et l’analyse à haut débit²⁰. Par conséquent, l’ELISA a été largement utilisé pour l’analyse quantitative ou semi-quantitative de composés, de protéines, d’anticorps ou de molécules dans les cellules 21,22,23. Par exemple, il a été utilisé dans la détection de biomarqueurs associés à diverses maladies, résidus de médicaments et biomolécules²⁴. Les tests ELISA peuvent être classés en quatre types principaux sur la base de la conception expérimentale et des principes²⁵. Ces méthodes comprennent l’ELISA direct, l’ELISA indirect, l’ELISA sandwich et l’ELISA compétitif^26,27. Parmi ceux-ci, l’ELISA sandwich, qui utilise deux anticorps spécifiques, l’un pour capturer la molécule cible et l’autre pour la détection, a été choisi pour l’étude de cet article. Le principe expérimental de l’ELISA sandwich est le suivant : tout d’abord, un anticorps spécifique est immobilisé dans les puits d’une microplaque pour capturer l’analyte d’intérêt. Après l’ajout de l’étalon ou de l’échantillon, l’analyte cible se lie à l’anticorps immobilisé. Par la suite, un anticorps marqué qui reconnaît un épitope différent sur l’antigène est ajouté, formant une structure sandwich. Après l’élimination des anticorps non liés, un substrat est ajouté. Sous l’action catalytique de l’anticorps secondaire, une réaction de couleur se produit, et l’intensité de la couleur est positivement corrélée à la concentration de l’analyte cible dans l’échantillon. Enfin, la densité optique (DO) a été mesurée pour déterminer la concentration de l’échantillon. L’ELISA sandwich présente les avantages d’une sensibilité et d’une spécificité accrues pour les échantillons cibles, ce qui le rend adapté à la détection de faibles concentrations d’analytes cibles et d’échantillons complexes²⁸. De plus, les résultats obtenus peuvent être quantifiés pour une analyse plus approfondie. Ces facteurs font de l’ELISA sandwich une méthode de détection couramment utilisée dans la recherche scientifique et les laboratoires cliniques²⁹.

Cette étude visait à détecter quantitativement le 8-oxo-dG dans les cellules MCF-7 afin de déterminer le degré de dommages oxydatifs de l’ADN dans les cellules. Cette étude se compose de deux parties principales : la construction d’un modèle de dommages oxydatifs de l’ADN cellulaire MCF-7 et la détection du 8-oxo-dG à l’aide d’ELISA. Tout d’abord, les cellules MCF-7 ont été cultivées in vitro et traitées avec différentes concentrations de H₂O₂ pendant différentes durées. La viabilité cellulaire a été évaluée à l’aide d’un test CCK-8 pour déterminer la concentration inhibitrice demi-maximale (IC₅₀) de H₂O₂ dans les cellules MCF-7. Sur la base des valeurs CI₅₀ , un temps de traitement_H2O₂ et une concentration d’induction appropriés ont été choisis. Pour extraire des échantillons de cellules MCF-7 endommagées par l’oxydation, des échantillons de cellules et de surnageants ont été obtenus et ajoutés à des puits liés à des enzymes préalablement enrobés d’anticorps 8-oxo-dG. Le 8-oxo-dG présent dans l’échantillon se liera aux anticorps liés au porteur en phase solide. Ensuite, des anticorps 8-oxo-dG marqués à la peroxydase de raifort ont été ajoutés. Le mélange réactionnel a été incubé à une température constante pour assurer une liaison complète de l’échantillon et de l’anticorps. L’enzyme non liée a été éliminée par lavage, puis le substrat colorimétrique a été ajouté, ce qui a produit une couleur bleue. Sous l’action de l’acide, la solution est devenue jaune. Enfin, la valeur de DO des échantillons de puits de réaction a été mesurée à 450 nm, et la concentration de 8-oxo-dG dans l’échantillon était proportionnelle à la valeur de DO. En générant une courbe standard, la concentration de 8-oxo-dG dans l’échantillon peut être calculée.

Protocol

1. Construction d’unmodèle d’endommagement oxydatif de l’ADN induit par H₂O₂ dans des cellules MCF-7

1. Récupération de cellules MCF-7
   1. Transférez rapidement le tube cryogénique de culture cellulaire, qui contient 3,5 x 10⁶ cellules MCF-7 et est stocké dans un réfrigérateur à -80 °C, dans une boîte en mousse contenant de l’azote liquide. Récupérez le tube à l’aide d’une pince et placez-le dans un bain-marie à température constante de 37 °C pendant environ 1 min pour décongeler les cellules préservées.
      REMARQUE : Pendant le processus de décongélation au bain-marie, secouez les cellules par intermittence pour assurer un chauffage uniforme du cryoflacon.
   2. Placez le cryoflacon dans une centrifugeuse et centrifugez-le à température ambiante à 150 x g pendant 5 min.
   3. À l’aide d’une pipette, jeter le surnageant du tube de stockage cryogénique et ajouter 1 mL de milieu de culture complet. Bien mélanger et transférer dans une boîte de culture de 10 mm, compléter 7 ml supplémentaires de milieu de culture complet.
   4. Agitez la boîte de culture de manière entrecroisée pour assurer un mélange uniforme, et cultivez dans un incubateur de CO₂ à 37 °C avec 5 % de CO₂.
      REMARQUE : Le milieu de culture complet est constitué d’un milieu de culture DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de pénicilline et de streptomycine.
2. Évaluation de la viabilité cellulaire
   1. Sélectionnez des cellules MCF-7 dans la phase de croissance logarithmique avec un bon état cellulaire pour l’expérience. Au cours de la phase de croissance logarithmique, les cellules présentent généralement un cycle de division plus court et une fréquence élevée de division cellulaire.
      1. Observez la morphologie et le taux de croissance des cellules MCF à l’aide d’un microscope électronique. Lorsque les cellules présentent une morphologie monocouche uniforme et densément tassée, et que la prolifération cellulaire est évidente, il peut être déterminé que les cellules sont essentiellement dans la phase de croissance logarithmique.
   2. Lavage des cellules : À l’aide d’une pipette, retirez le milieu de culture de la boîte de culture, ajoutez 1 ml de tampon PBS pour laver les cellules, puis jetez le PBS.
   3. Détachement cellulaire : Ajouter 1 mL de trypsine pour laver les cellules, attendre environ 1 min pour que la trypsine détache complètement les cellules de la boîte de culture. Tapotez doucement la coupelle de culture ; observation des mouvements cellulaires
      en feuilles indique un détachement complet de la cellule.
   4. Fin du détachement cellulaire et comptage des cellules : Ajouter 8 mL de milieu de culture complet pour terminer le détachement, pipeter doucement les cellules et déterminer la concentration en suspension cellulaire à l’aide d’un appareil de comptage cellulaire.
      REMARQUE : Assurez-vous que la suspension cellulaire est homogène avant de compter en pipetant doucement de haut en bas.
   5. Ensemencement cellulaire : Ajustez la suspension cellulaire diluée pour obtenir une densité cellulaire de 5 000 cellules par 100 μL. Inocuculez la suspension cellulaire dans 21 puits d’une plaque de 96 puits à l’aide d’un pistolet à pipette, en distribuant 100 μL dans chaque puits. Ajouter 100 μL de tampon PBS aux puits environnants des puits ensemencés pour éviter une évaporation excessive du milieu de culture.
   6. Préparation d’un milieu contenant du H₂O₂ : Choisir 9 puits sur la plaque de culture cellulaire à 12 puits et attribuer des étiquettes en fonction du gradient des concentrations en H₂O₂ (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0 mM). Ajouter 720 μL de milieu complet dans les puits étiquetés comme 2,0 mM et 1,5 mM et ajouter 360 μL de milieu complet dans les puits restants.
      1. À l’aide d’une pipette, versez 1,63 μL et 1,22 μL de réactif 3 % H₂O₂ dans les puits étiquetés comme 2,0 mM et 1,5 mM, respectivement. Mélangez bien la solution. À l’aide d’une pipette, transvaser 360 μL de 2,0 mM H₂O₂ dans le 1,0 mM bien étiqueté et mélanger ; ensuite, transvaser 360 μL de 1,0 mM H₂O₂ dans le 0,5 mM bien marqué et mélanger ; et enfin transférer 360 μL de 0,5 mM H₂O₂ dans le 0,25 mM bien marqué. Pipette 360 μL de 1,5 mM H₂O₂ dans le puits bien étiqueté de 0,75 mM pour diluer et atteindre la concentration souhaitée. (Figure 1).
         REMARQUE : Assurez-vous que la solution mère H₂O₂ dans la pipette est complètement transférée dans les puits pour éviter toute solution résiduelle. Assurez-vous de bien mélanger les solutions avant de procéder à la dilution.
   7. Incubation : Après environ 24 h d’ensemencement cellulaire, à l’aide d’une pipette, retirer le milieu de culture de la plaque à 96 puits une fois que les cellules ont adhéré aux surfaces. Selon le gradient de concentration, ajouter le milieu contenant du H₂O₂ respectif dans chaque puits. Remettez la plaque dans l’incubateur pendant 12 h.
   8. Ajout du réactif CCK-8 : Après la période de traitement désignée de 12 h, utiliser une pipette pour retirer le milieu de culture de la plaque à 96 puits, ajouter 100 μL de milieu de culture complet et 10 μL de réactif CCK-8 dans chaque puits, et inclure trois puits de contrôle à blanc. Incuber la plaque à 37 °C pendant 2 h.
      REMARQUE : Pendant le processus d’ajout d’échantillons, évitez la formation de bulles pour éviter toute interférence avec la lecture de la valeur OD.
   9. Mesure de l’absorbance : Sortez la plaque à 96 puits de l’incubateur, mesurez l’absorbance à une longueur d’onde de 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques et enregistrez les résultats.
   10. Selon la formule de calcul de l’IC₅₀ ,
       taux d’inhibition (%) = (DO du groupe expérimental du médicament-DO moyenne du trou de contrôle du médicament)/ (DO moyenne du trou de contrôle cellulaire-DO moyenne du trou de contrôle du médicament) x 100%
       Calculer les résultats en pourcentage de l’absorbance dans les cultures témoins.
   11. Importez les données expérimentales traitées dans un logiciel d’analyse statistique, sélectionnez le type d’analyse Régression non linéaire, construisez le modèle logistique à quatre paramètres et cliquez sur le bouton Ajuster la courbe pour l’ajustement de la courbe . Après le processus de montage, le logiciel calculera automatiquement la valeur IC₅₀ .
3. Expérience d’oxydation cellulaire MCF-7 induite par H₂O₂
   1. Récupérer des cellules MCF-7 dans la phase de croissance logarithmique avec un bon état cellulaire pour l’expérimentation.
   2. Lavez, effectuez le détachement des cellules, terminez le détachement et comptez les cellules (reportez-vous à l’étape 1.2 pour les méthodes spécifiques).
   3. Ensemencement cellulaire : Ajuster la densité de la suspension cellulaire à 1 x 10⁶ cellules par boîte, avec 4 mL de suspension par boîte de 6 cm de diamètre.
   4. Étiquetez deux tubes de microcentrifugation de 5 mL comme 0,25 mM et 0,75 mM 3% H₂O₂. Ajouter 4 mL de milieu complet dans chaque tube, puis ajouter 1,13 μL et 3,40 μL de 3 % H₂O₂, respectivement. Secouez doucement les tubes pour assurer un mélange complet. Remplacer le milieu de culture dans les trois boîtes par un milieu complet contenant des concentrations de H₂O₂ de 0, 0,25 et 0,75 mM.
   5. Incuber les cultures : Remettre les plats dans l’incubateur pendant 12 h.

2. Préparation des échantillons cellulaires et préparation des réactifs ELISA

1. Collecte d’échantillons d’extraits cellulaires
   1. Prélèvement d’échantillons : Jeter le surnageant de culture cellulaire MCF-7, rincer, effectuer le détachement des cellules, mettre fin au détachement et prélever les cellules. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml.
   2. Centrifugation : Centrifuger à 800 x g pendant 5 min pour recueillir la pastille cellulaire. Ajouter 200 μL de PBS pour remettre en suspension chaque échantillon cellulaire et perturber les cellules par des cycles répétés de congélation-décongélation. Centrifuger le lysat cellulaire à 1 500 x g pendant 10 min et utiliser une pipette pour recueillir le surnageant à des fins d’analyse.
      REMARQUE : Lorsque la quantité de cellules est faible, réduisez le volume de PBS utilisé pour la remise en suspension. Les échantillons peuvent être conservés à 4 °C jusqu’à 1 semaine si une analyse immédiate n’est pas possible. Pour un stockage à long terme, aliquotez les échantillons en fonction des quantités à usage unique et conservez-les à -80 °C pour éviter les cycles répétés de gel-dégel.
2. Préparation des réactifs ELISA
   1. Décongélation des réactifs : Laisser les réactifs ELISA, y compris les films d’étanchéité, les plaques pré-enrobées, les étalons, le diluant d’échantillon, l’anticorps de détection-HRP, le substrat chromogène, la solution d’arrêt, le tampon de lavage concentré (20x) et les échantillons d’essai atteindre la température ambiante (18-25 °C) pendant 20 min avant de commencer le test. Pré-ouvrez le lecteur ELISA 15 min avant de l’utiliser.
   2. Préparation du tampon de lavage : Calculez le volume requis de tampon de lavage dilué, puis diluez 20 fois le tampon de lavage concentré avec de l’eau distillée ou désionisée dans 1 solution de travail. Retournez tout tampon de lavage concentré inutilisé dans le réfrigérateur à 4 °C.
      REMARQUE : Le tampon de lavage doit être préparé frais avant utilisation. Si des cristaux sont présents dans le tampon de lavage concentré conservé dans le réfrigérateur, laissez-le atteindre la température ambiante et secouez-le doucement jusqu’à ce que les cristaux se dissolvent complètement avant de l’utiliser.
   3. Préparation de la norme
      1. Préparer des solutions de travail d’échantillons étalons à des concentrations de 1,25, 2,5, 5, 10, 20 et 40 ng/mL, respectivement. Pour garantir l’exactitude des résultats expérimentaux, mélangez soigneusement les échantillons standard de haut en bas avant utilisation afin d’éviter la formation de bulles pendant le processus de dissolution.

3. Expérience ELISA

1. Revêtement des plaques : Concevez à l’avance le nombre total de puits pour les étalons, les échantillons et les ébauches/contrôles et retirez les bandes de plaques requises. Ajouter 50 μL de solution de travail standard et des échantillons de détection de différentes concentrations dans les puits de réaction. Effectuer les étalons en trois exemplaires et s’abstenir d’ajouter des échantillons dans les puits blancs/de contrôle²⁵.
   REMARQUE : Les étapes expérimentales du test ELISA sont illustrées schématiquement à la figure 2. Si la concentration de l’échantillon dépasse la plage de détection, l’échantillon doit être dilué avec un diluant avant l’échantillonnage. Lors de l’ajout d’échantillons, ajoutez-les au fond de la plaque, en évitant de toucher les parois du puits, secouez doucement pour mélanger et évitez la formation de bulles. Pour garantir l’exactitude de l’expérience, chaque ajout d’échantillon doit être effectué dans un délai de 10 minutes.
2. Incubation : À l’exception des puits vierges, ajouter 100 μL d’anticorps de détection conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) dans chaque puits de réaction, sceller les puits à l’aide d’une plaque d’étanchéité et incuber à 37 °C pendant 60 minutes dans un incubateur à température constante.
3. Lavage : Jetez le liquide, secouez le liquide dans les puits de la plaque, séchez sur du papier absorbant, ajoutez 350 μL de tampon de lavage dans chaque puits de réaction, laissez reposer pendant 1 à 2 minutes, puis jetez le tampon de lavage. Répétez le processus de lavage 5 fois.
   REMARQUE : Un lavage en profondeur est crucial car il affecte directement la précision des résultats expérimentaux. Assurez-vous que le tampon de lavage est complètement secoué après chaque lavage. Essuyez soigneusement tout résidu sur le fond de la plaque après le lavage pour éviter d’affecter la mesure de l’absorbance.
4. Réaction de couleur : Ajouter 50 μL de substrat A et 50 μL de substrat B dans chaque puits de réaction, sceller la plaque et incuber à 37 °C dans l’obscurité pendant 15 min.
   REMARQUE : Après avoir ajouté le réactif de couleur, observez rapidement le changement de couleur dans les puits de réaction. Si la couleur est trop foncée, ajoutez la solution d’arrêt pour terminer la réaction plus tôt.
5. Terminez la réaction et mesurez l’absorbance : ajoutez 50 μL de solution stop dans chaque puits de réaction et mesurez immédiatement la valeur de DO à une longueur d’onde de 450 nm avec un lecteur ELISA (dans les 15 minutes).
6. Analyse des données : Importez les données expérimentales traitées dans le logiciel d’analyse statistique, sélectionnez le type d’analyse Régression linéaire. Construisez une courbe d’étalonnage en traçant la concentration des étalons sur l’axe des X par rapport aux valeurs de densité optique (DO) sur l’axe des Y. Utiliser la courbe d’étalonnage établie pour déterminer la concentration de 8-oxo-dG présente dans les échantillons. Construisez un modèle mathématique logistique et cliquez sur le bouton Ajuster la courbe pour l’ajustement de la courbe. Après le processus de montage, le logiciel calcule automatiquement la courbe standard et la valeur P.
   REMARQUE : La courbe standard ne peut pas être réutilisée et doit être déterminée à nouveau pour chaque expérience.

Results

Comme l’illustre la figure 3, l’axe des X désigne la concentration de H₂O₂ appliquée aux cellules MCF-7, tandis que l’axe des Y indique la viabilité des cellules. Le traitement avec 0,75 mM pendant 12 h a réduit la viabilité des cellules MCF-7 à 67 %. Parallèlement à l’augmentation de la concentration, il y a eu une diminution significative de la viabilité des cellules MCF-7, en particulier à une concentration de 1,5 mM, où la viabilité a diminué à moins de 3 % (tableau 1). Les résultats expérimentaux ont suggéré un IC₅₀ de 0,7655 mM pour les cellules MCF-7.

Dans cette série d’expériences, nous avons utilisé une technique ELISA améliorée pour la quantification des niveaux de 8-oxo-dG. Grâce à l’analyse des données, l’équation de régression de la courbe standard est la suivante :

Y = 23,66 × X + 0,07038.

Comme le montre la figure 4A, la courbe d’étalonnage a montré une linéarité élevée (R² = 0,978), et la figure 4B montre que les relations entre les concentrations mesurées de 8-oxo-dG dans les échantillons et les quantités ajoutées correspondantes étaient fortement corrélées, ce qui indique une bonne précision (le coefficient de variation était inférieur à 5 %). De plus, la cohérence des résultats obtenus sur plusieurs répétitions indique la fiabilité et la reproductibilité de la méthode expérimentale.

En résumé, les données expérimentales indiquent que notre méthode ELISA optimisée est capable de détecter avec succès les fluctuations des niveaux de 8-oxo-dG dans des conditions bien contrôlées. Cela a des implications importantes pour les applications futures de cette technique dans un plus large éventail de types d’échantillons pour surveiller les dommages à l’ADN causés par le stress oxydatif. Malgré certaines limites, les perspectives d’application de la méthode semblent prometteuses après optimisation des conditions expérimentales.

Figure 1 : Préparation des dilutions de H₂O₂. Le schéma de principe décrit la méthode de préparation des dilutions de peroxyde d’hydrogène (H₂O₂), impliquant la combinaison méticuleuse de solutions et le transfert précis de concentrations variées de H₂O₂ dans des tubes étiquetés comme 1,0 mM, 0,5 mM et 0,25 mM respectivement. La concentration visée est obtenue en transférant 1,5 mM H₂O₂ dans le tube désigné comme 0,75 mM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Dosage immuno-enzymatique (ELISA) pour la détection d’antigènes. Cette illustration schématique illustre les étapes séquentielles d’un test immuno-enzymatique (ELISA) pour la détection d’antigènes : Ajout d’échantillons et préparation à blanc ; incubation de l’antigène marqué HRP ; lavage et préparation des assiettes ; l’ajout et l’incubation du substrat ; la terminaison de réaction et la mesure de la densité optique (DO). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : H₂O₂ a inhibé la prolifération cellulaire MCF-7. La viabilité cellulaire a été évaluée par un essai CCK-8 traité avec diverses concentrations de H₂O₂ (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5 ou 2,0 mM) pendant 12 h et une CI₅₀ a été calculée pour l’état indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse quantitative du 8-oxo-dG dans les cellules MCF-7 après traitement par H₂O₂. (A) Courbe standard ELISA pour le 8-oxo-dG. Décrit la relation entre les concentrations connues de 8-oxo-dG (1,25, 2,5, 5, 10, 20 et 40 ng/mL) et leurs valeurs d’absorbance respectives. L’équation de régression de la courbe standard est Y = 23,66 × X + 0,07038. (n = 3, R² = 0,978). (B) Concentration de 8-oxo-dG dans les cellules MCF-7 traitées en H₂O₂. Le graphique montre les niveaux de 8-oxo-dG dans les cellules MCF-7 soumises à différentes concentrations de H₂O₂ (0, 0,25 et 0,75 mM). Chaque point de données représente la moyenne ± SE (erreur type) de trois expériences indépendantes (n = 3), illustrant l’impact du stress oxydatif sur les dommages à l’ADN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Paramètre
Concentration H2O2 , mM	0	0.25	0.5	0.75	1	2
Viabilité des cellules MCF-7, %	100	82.8	81.37	61.07	13.4	2.77

Tableau 1 : Viabilité cellulaire des cellules MCF-7 traitées avec_H2O₂.

Discussion

Le développement de méthodes ELISA revêt une grande importance pour les méthodologies existantes et nouvelles de détection des dommages à l’ADN. Par rapport aux techniques traditionnelles de HPLC et de spectrométrie de masse, cette approche est non seulement conviviale, mais présente également une sensibilité élevée et répond aux exigences du criblage à haut débit³⁰. Cela permet de surveiller le 8-oxo-dG dans des études de dépistage de maladies à grande échelle, ce qui facilite une meilleure compréhension de la corrélation entre ce biomarqueur et diverses maladies.

Au cours des procédures expérimentales, plusieurs étapes critiques sont essentielles pour garantir la fiabilité et la reproductibilité des résultats. Initialement, l’expérience a évalué avec compétence la sensibilité des cellules MCF-7 à H₂O₂, avec une valeur IC₅₀ de 0,7655 mM à 12 h, mettant en évidence le niveau de tolérance des cellules MCF-7. Ce résultat est d’une grande importance scientifique pour la compréhension des mécanismes de défense antioxydants des cellules MCF-7 et de leur survie sous stress oxydatif, tout en fournissant un indicateur de référence important pour le dépistage futur des médicaments antioxydants ou des mécanismes de traitement connexes³¹. De plus, la sélection et l’appariement des anticorps 8-oxo-dG sont essentiels pour la détection ELISA et affectent directement la spécificité et la sensibilité du système de détection ELISA. De plus, l’optimisation de la stratégie d’amplification du signal et des étapes de traitement des échantillons sont des facteurs importants qui affectent la précision de la détection. Nous avons constaté que l’utilisation d’un système de réaction de substrat stable peut réduire les erreurs de fond et augmenter la plage de sensibilité de détection.

Au cours du processus expérimental, des problèmes techniques tels que des anticorps instables, des fluctuations de signal et une réactivité croisée des réactifs peuvent survenir. Pour résoudre ces problèmes, nous avons adopté un protocole expérimental plus stable, qui comprenait l’utilisation de solvants d’anticorps stables pour améliorer la stabilité des anticorps et l’optimisation et l’ajustement des conditions expérimentales. De plus, pour remédier à l’erreur causée par les fluctuations du signal, nous avons normalisé l’expérience en utilisant des échantillons standard de 8-oxo-dG pour assurer la cohérence des résultats.

En ce qui concerne les limites de la méthode expérimentale, bien que l’ELISA offre une approche à haut débit, elle peut encore être limitée par la couverture spécifique en anticorps et l’inévitable réactivité croisée du substrat³². Par conséquent, des étapes supplémentaires de purification ou de prétraitement des échantillons peuvent être nécessaires pour les échantillons complexes. De plus, la détection d’échantillons présentant des concentrations plus faibles peut nécessiter une optimisation supplémentaire de l’activité des anticorps pour répondre aux exigences de la recherche.

En conclusion, la méthode de détection ELISA du 8-oxo-dG a des implications importantes pour des domaines de recherche spécifiques. Il a une valeur d’application potentielle dans la surveillance de l’environnement, l’évaluation des risques de maladies et le diagnostic précoce et fournit une nouvelle approche de détection du 8-oxo-dG dans l’agriculture, la sécurité alimentaire et le dépistage des médicaments³³. Par exemple, dans le cadre de la biosurveillance environnementale, la détection du stress des dommages oxydatifs de l’ADN causé par les toxines environnementales dans les organismes peut aider à identifier les risques potentiels en temps opportun³⁴. À l’avenir, avec l’optimisation accrue de la technologie de détection et son application dans plusieurs disciplines, cette méthode devrait jouer un rôle plus critique dans la recherche en sciences de la vie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 % Trypsine-EDTA(1x)	Gibco	25200-072
Kit de comptage cellulaire-8	Dojindo	CK04
Plaque de comptage	QiuJing	XB-K-25
CO2 incubateur	Thermo	51032872
DMEM basic(1X)	Gibco	C11995500BT
FBS	PAN	ST30-3302
GraphPad Prism X9	Logiciel GraphPad Logiciel		d’analyse statistique
à grande vitesse Thermo		; 9AQ2861
Humain 8-oxo-dG ELISA Kit	Zcibio	ZC-55410
L-1000XLS+ Pipettes	Rainin	17014382
L-20XLS+ Pipettes	Rainin	17014392
réservoir d’azote liquide	Mvecryoge	YDS-175-216
MCF-7 CELL	BNCC	BNCC100137
Photomètre microplaque Multiskan FC	Thermo	1410101
PBS	Solarbio	P1020
Pénicilline-Streptomycine Solution, 100X	Beyotime	C0222
Microscope trinoculaire à cellules vivantes	Motic	1.1001E+12
Congélateur ultra-basse température	Haire	V118574