Generazione e analisi di immagini istologiche ad alto parametro con la citometria a flusso istodinamico
Summary
Qui descritto è un metodo che può essere utilizzato per visualizzare cinque o più parametri fluorescenti mediante microscopia immunofluorescente. Viene delineata una pipeline di analisi per estrarre singole cellule da queste immagini e condurre analisi di singole cellule attraverso strategie di gating simili alla citometria a flusso, in grado di identificare sottogruppi di cellule in sezioni di tessuto.
Abstract
L’uso dell’istologia per studiare la diversità delle cellule immunitarie in sezioni di tessuto, come quelle derivate dal sistema nervoso centrale (SNC), è limitato in modo critico dal numero di parametri fluorescenti che possono essere visualizzati contemporaneamente. La maggior parte dei sottogruppi di cellule immunitarie è stata definita utilizzando la citometria a flusso utilizzando combinazioni complesse di marcatori proteici, che spesso richiedono quattro o più parametri per essere identificati in modo definitivo, il che va oltre le capacità della maggior parte dei microscopi convenzionali. Poiché la citometria a flusso dissocia i tessuti e perde informazioni spaziali, sono necessarie tecniche in grado di conservare le informazioni spaziali mentre interrogano i ruoli dei tipi di cellule complesse. Questi problemi sono affrontati qui creando un metodo per espandere il numero di parametri fluorescenti che possono essere visualizzati raccogliendo i segnali dei fluorofori spettralmente sovrapposti e utilizzando l’unmixing spettrale per separare i segnali di ogni singolo fluoroforo. Queste immagini vengono quindi elaborate utilizzando una pipeline di analisi per acquisire immagini istologiche ad alto parametro ed estrarre singole cellule da queste immagini in modo che le proprietà fluorescenti uniche di ciascuna cellula possano essere analizzate a livello di singola cellula. Utilizzando strategie di gating simili alla citometria a flusso, le cellule possono quindi essere profilate in sottogruppi e mappate nuovamente sulle sezioni istologiche non solo per quantificare la loro abbondanza, ma anche per stabilire come interagiscono con l’ambiente tissutale. Nel complesso, è stata dimostrata la semplicità e il potenziale dell’utilizzo della citometria a flusso istologico per studiare popolazioni immunitarie complesse nelle sezioni istologiche.
Introduction
L’infiammazione guidata dalle cellule del sistema immunitario e dalle cellule gliali può contribuire a disturbi cronici del SNC in cui ogni popolazione può promuovere l’attività dell’altra 1,2,3. Capire come il sistema immunitario interagisce con questi elementi del SNC per promuovere l’infiammazione del SNC è attualmente un argomento di grande interesse ed è stato notevolmente facilitato da tecniche ad alto parametro come il sequenziamento dell’RNA a singola cellula. Attraverso il sequenziamento dell’RNA a singola cellula, abbiamo scoperto che esiste un’ampia comunicazione tra le cellule gliali e il sistema immunitario in diversi disturbi del SNC 4,5,6. Capire come queste interazioni stanno influenzando questi disturbi sarà fondamentale per chiarire la biologia di queste malattie.
Un problema con le analisi di sequenziamento di singole cellule è che queste tecniche richiedono che il tessuto venga distrutto per ottenere singole cellule o nuclei, con conseguente perdita completa di informazioni spaziali. Sapere dove si trova una cellula in un tessuto è fondamentale per comprendere il ruolo della cellula nel guidare l’infiammazione. Ad esempio, le cellule immunitarie come le cellule B possono concentrarsi nel SNC durante la neuroinfiammazione; tuttavia, raramente entrano nel parenchima del SNC e si concentrano invece nelle barriereSNC 7. Data la loro localizzazione, è improbabile che queste cellule contribuiscano all’infiammazione del SNC interagendo fisicamente con le cellule gliali nel parenchima del SNC, suggerendo che qualsiasi interazione che potrebbero avere con le cellule gliali si verificherebbe attraverso fattori secrenti. Inoltre, la patologia che si verifica nei disturbi del SNC ha spesso una struttura 8,9 tale che la localizzazione di una cellula nel tessuto potrebbe determinare in modo critico se sta contribuendo attivamente al disturbo o è uno spettatore. Pertanto, l’uso dell’orientamento spaziale per valutare il ruolo di una cellula nella patologia è essenziale.
Lo studio delle cellule nei tessuti è stato in genere realizzato utilizzando l’immunoistochimica o la microscopia a fluorescenza immunitaria. Un problema con queste tecniche è che in genere possono visualizzare solo fino a quattro parametri contemporaneamente. Questo è un grosso limite a queste tecniche, poiché sappiamo dalla citometria a flusso e dalle analisi di sequenziamento dell’RNA a singola cellula che molte popolazioni cellulari richiedono due o più parametri per la loro identificazione; Inoltre, il numero di parametri richiesti aumenta in genere quando si cercano sottoinsiemi specifici di un tipo di cella10. Pertanto, non è pratico utilizzare tecniche di imaging standard per studiare come sottogruppi di cellule possono interagire all’interno di un tessuto.
Questo problema è stato parzialmente superato attraverso nuovi metodi ad alto parametro in grado di conservare le informazioni spaziali, come il sequenziamento spaziale dell’RNA11 e la citometria di massa per imaging12. Sebbene queste tecniche siano preziose, presentano diversi problemi, come la non essere ampiamente disponibili, la riduzione dei dati tridimensionali in due dimensioni e la richiesta di una notevole esperienza per l’esecuzione. Un’altra tecnica nota come colorazione sequenziale, in cui i tessuti vengono colorati con una serie di anticorpi seguita dall’inattivazione della precedente serie di anticorpi prima di colorare con un’altra serie di anticorpi, può ottenere un’istologia ad alto parametro senza la necessità di attrezzature specializzate o competenze 13,14,15. Tuttavia, la colorazione sequenziale può essere estremamente laboriosa e richiede una grande quantità di tempo di microscopia, il che può essere poco pratico per i laboratori che non possiedono un microscopio personale. Pertanto, c’è bisogno di tecniche in grado di espandere il numero di parametri fluorescenti che possono essere visualizzati contemporaneamente su microscopi ampiamente disponibili e in modo tempestivo.
Una volta acquisiti i dati ad alto parametro, sorge un altro problema: è improbabile che i metodi convenzionali di analisi delle immagini riescano ad analizzare con successo i dati. Tecniche come il conteggio manuale o la soglia sono praticabili solo se l’analisi consiste in un singolo parametro o se più marcatori hanno la stessa localizzazione in cui vengono contati solo i segnali sovrapposti. Questa limitazione rende l’analisi tradizionale inadeguata per lavorare con set di dati ad alto parametro. L’analisi di successo di questi set di dati è stata ottenuta segmentando singole cellule da immagini istologiche e quindi conducendo strategie di gating simili alla citometria a flusso per identificare i tipi di cellule16,17. Tuttavia, un altro problema che influisce su queste analisi è che funzionano solo per set di dati in cui tutte le cellule di interesse sono fisicamente separate l’una dall’altra, poiché queste tecniche non impiegano metodi in grado di separare accuratamente le cellule che sono in contatto fisico. Pertanto, è necessario un metodo più recente in grado di condurre analisi di singole cellule su sezioni istologiche anche se le cellule sono in contatto fisico.
In questo articolo viene descritto un semplice protocollo chiamato citometria a istoflusso che è stato precedentemente introdotto18 che espande il numero di parametri fluorescenti che possono essere visualizzati contemporaneamente utilizzando microscopi ampiamente disponibili. Questo protocollo funziona colorando i tessuti con coloranti spettralmente sovrapposti e quindi utilizzando la compensazione spettrale per rimuovere il sanguinamento dai canali sovrapposti per ottenere singole colorazioni chiare. Per facilitare l’analisi di immagini istologiche ad alto parametro, viene descritta una pipeline di analisi dettagliata che estrae singole cellule da sezioni di tessuto allo scopo di smistare le cellule in popolazioni distinte utilizzando strategie di gating simili alla citometria a flusso. Questo protocollo funziona nei tessuti in cui le cellule sono diffusamente presenti e nei tessuti in cui le cellule sono strettamente compattate insieme, rendendo questa tecnica versatile per lo studio di tessuti come il SNC sia nell’omeostasi che nella neuroinfiammazione. La citometria a istoflusso è, quindi, una tecnica utile per studiare le interazioni tra tipi di cellule complesse che richiedono più marcatori cellulari per definire le cellule mantenendo le informazioni spaziali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui viene descritto l’uso della citometria a istoflusso, una tecnica che è stata convalidata in precedenza18. È dimostrato che quando si colorano sezioni di tessuto con coloranti spettralmente sovrapposti, il sanguinamento attraverso i canali può essere rimosso utilizzando la compensazione spettrale, con conseguente risoluzione chiara di un numero maggiore di parametri fluorescenti rispetto a quanto sarebbe normalmente possibile con i metodi convenzionali. Poiché le immagini istologiche ad alt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l’Hotchkiss Brain Institute Advanced Microscopy Platform per l’infrastruttura di imaging e l’esperienza. RWJ è stato supportato da borse di studio post-dottorato del programma Eyes High dell’Università di Calgary e da una Multiple Sclerosis Society of Canada e da una borsa di studio educativa illimitata Roche Canada. VWY ha ricevuto un sostegno salariale dal programma Canada Research Chair Tier 1. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi operativi del Canadian Institutes of Health Research Grant 1049959, della Multiple Sclerosis Society of Canada Grant 3236 e del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti del Programma di ricerca sulla sclerosi multipla diretto dal Congresso. La Figura 1 viene creata con BioRender.com. Le cifre adattate in questa pubblicazione sono state originariamente pubblicate su The Journal of Immunology. Rajiv W. Jain, David A. Elliott e V. Wee Yong. 2023. Analisi di singole cellule di immagini istologiche ad alto parametro mediante citometria a istoflusso. J. Immunol. 210: 2038-2049. Diritto d’autore © [2023]. L’Associazione Americana degli Immunologi, Inc.
Materials
| 100% Ethanol | Sigma | 676829-1L | |
| 4% PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | https://www.anaconda.com/download |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4503-50G | |
| Cold fish stain gelatin | Sigma | G7765 | |
| Collating multichannel data from Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | 1:300 concentration |
| Donkey anti-rat DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | 1:200 concentration |
| Donkey Serum | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | 1:25 concentration |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software 4 | |
| Fluorescence spectraviewer | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Fresh frozen human tonsil sections | amsbio | HF-707 | |
| Glass coverslip | VWR | 48393 106 | |
| Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgG Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgM Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | 1:300 concentration |
| Goat anti-rabbit A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | 1:250 concentration |
| Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | 1:250 concentration |
| Horse Serum | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/ |
| Ilastik FIJI plugin | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | Software 2 | |
| Imaris with cell module | Oxford Instruments | Software 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX Life Science software | Leica | Software 1 | |
| Mouse anti-human CD20 | VWR | CA95024-322 | 1:40 concentration |
| Mouse anti-human CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 concentration |
| Normal Goat Serum | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Normal Mouse Serum | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| Normal Rabbit Serum | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| Normal Rat Serum | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| Nuclear Yellow | Abcam | ab138903 | Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark |
| PAP pen | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Rabbit anti-human Ki67 | Abcam | ab15580 | 1:500 concentration |
| Rabbit anti-mouse Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:500 concentration |
| Rat anti-human Blimp1 | Thermofisher | 14-5963-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | 1:250 concentration |
| Rat anti-mouse CD138 | Biolegend | 142502 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700 | BD Biosciences | 565478 | 1:50 concentration |
| Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | 1:50 concentration |
| SP8 Confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
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