Histoflow Cytometry를 이용한 High-parameter Histology 이미지 생성 및 분석
Summary
여기에는 면역형광 현미경으로 5개 이상의 형광 파라미터를 이미지화하는 데 사용할 수 있는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 이미지에서 단일 세포를 추출하고 유세포 분석과 같은 게이팅 전략을 통해 단일 세포 분석을 수행하기 위한 분석 파이프라인이 간략하게 설명되어 있으며, 이를 통해 조직 절편의 세포 subset을 식별할 수 있습니다.
Abstract
중추 신경계(CNS)에서 유래한 것과 같은 조직 절편의 면역 세포 다양성을 조사하기 위해 조직학을 사용하는 것은 한 번에 이미징할 수 있는 형광 매개변수의 수에 의해 매우 제한됩니다. 대부분의 면역 세포 subset은 단백질 마커의 복잡한 조합을 사용하여 유세포 분석을 사용하여 정의되었으며, 종종 결정적으로 식별하기 위해 4개 이상의 매개변수가 필요하며, 이는 대부분의 기존 현미경의 기능을 벗어납니다. 유세포 분석은 조직을 해리하고 공간 정보를 잃기 때문에 복잡한 세포 유형의 역할을 조사하는 동안 공간 정보를 유지할 수 있는 기술이 필요합니다. 여기에서는 스펙트럼적으로 중첩되는 형광단의 신호를 수집하고 스펙트럼 불혼합을 사용하여 각 개별 형광단의 신호를 분리함으로써 이미징할 수 있는 형광 파라미터의 수를 확장하는 방법을 만들어 이러한 문제를 해결합니다. 그런 다음 이러한 이미지는 분석 파이프라인을 사용하여 고파라미터 조직학 이미지를 취하고 이러한 이미지에서 단일 세포를 추출하여 각 세포의 고유한 형광 특성을 단일 세포 수준에서 분석할 수 있습니다. 그런 다음 유세포 분석과 같은 게이팅 전략을 사용하여 세포를 subset으로 프로파일링하고 조직학 섹션에 다시 매핑하여 세포의 존재도를 정량화할 뿐만 아니라 세포 환경과 상호 작용하는 방식을 규명할 수 있습니다. 전반적으로, 조직학 섹션에서 복잡한 면역 집단을 연구하기 위해 histoflow 세포분석을 사용하는 것의 단순성과 잠재력이 입증되었습니다.
Introduction
면역 체계와 신경교세포의 세포에 의해 유발되는 염증은 각 집단이 다른 1,2,3의 활동을 촉진할 수 있는 CNS의 만성 장애에 기여할 수 있습니다. 면역 체계가 중추신경계의 이러한 요소와 상호 작용하여 중추신경계 염증을 촉진하는 방법을 이해하는 것은 현재 주요 관심 주제이며 단세포 RNA 염기서열 분석과 같은 고분자 기술에 의해 크게 촉진되었습니다. 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 통해 우리는 여러 CNS 질환에서 신경교세포와 면역 체계 사이에 광범위한 통신이 발생한다는 것을 발견했습니다 4,5,6. 이러한 상호 작용이 이러한 장애에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 것은 이러한 질병의 생물학을 설명하는 데 중요합니다.
단일 세포 염기서열 분석 분석의 한 가지 문제는 이러한 기술을 사용하여 단일 세포 또는 핵을 얻기 위해 조직을 파괴해야 하므로 공간 정보가 완전히 손실된다는 것입니다. 조직에서 세포가 어디에 존재하는지 아는 것은 염증을 유발하는 세포의 역할을 이해하는 데 중요합니다. 예를 들어, B 세포와 같은 면역 세포는 신경 염증 중에 CNS에 농축 될 수 있습니다. 그러나 그들은 CNS 실질에 거의 들어가지 않고 대신 CNS 장벽7에 집중합니다. 그들의 국소화를 감안할 때, 이러한 세포가 CNS 실질의 신경교세포와 물리적으로 상호 작용하여 CNS 염증에 기여할 가능성은 낮으며, 이는 신경교세포와 가질 수 있는 모든 상호 작용이 분비된 인자를 통해 발생할 것임을 시사합니다. 또한, 중추신경계 장애에서 발생하는 병리학은 종종 구조 8,9를 가지고 있어 조직 내 세포의 국소화가 세포가 장애에 적극적으로 기여하고 있는지 아니면 방관자인지를 비판적으로 결정할 수 있습니다. 따라서 병리학에서 세포의 역할을 평가하기 위해 공간 방향을 사용하는 것이 필수적입니다.
조직 내 세포 연구는 일반적으로 면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 면역 형광 현미경(immune fluorescence microscopy)을 사용하여 수행되어 왔습니다. 이러한 기술의 문제점은 일반적으로 최대 4개의 매개변수만 동시에 이미지화할 수 있다는 것입니다. 이는 유세포 분석 및 단일 세포 RNA 염기서열 분석 분석을 통해 많은 세포 집단이 식별을 위해 두 개 이상의 매개변수를 필요로 한다는 것을 알고 있기 때문에 이러한 기술의 주요 제한 사항입니다. 또한, 필요한 파라미터의 수는 세포 유형(10)의 특정 서브셋을 찾을 때 전형적으로 증가한다. 따라서 세포의 부분 집합이 조직 내에서 어떻게 상호 작용할 수 있는지 연구하기 위해 표준 이미징 기술을 사용하는 것은 비실용적입니다.
이 문제는 공간 RNA 염기서열분석(spatial RNA sequencing)11 및 이미징 질량 세포분석(imaging mass cytometry)12과 같은 공간 정보를 유지할 수 있는 새로운 고-파라미터 방법을 통해 부분적으로 극복되었다. 이러한 기술은 유용하지만 널리 사용할 수 없고, 3차원 데이터를 2차원으로 줄이고, 실행하는 데 상당한 전문 지식이 필요한 등 몇 가지 문제가 있습니다. 순차적 염색(sequential staining)으로 알려진 또 다른 기법은 조직을 한 세트의 항체로 염색한 후 다른 항체 세트로 염색하기 전에 이전 항체 세트를 비활성화하는 것으로, 특수 장비나 전문 지식 없이도 고-파라미터 조직학을 달성할 수 있다 13,14,15. 그러나 순차적 염색은 매우 노동 집약적일 수 있으며 많은 현미경 검사 시간이 필요하므로 개인용 현미경이 없는 실험실에는 실용적이지 않을 수 있습니다. 따라서 널리 사용 가능하고 적시에 현미경에서 한 번에 이미지화할 수 있는 형광 파라미터의 수를 확장할 수 있는 기술이 필요합니다.
일단 높은 파라미터 데이터가 수집되면, 또 다른 문제가 발생한다: 기존의 이미지 분석 방법으로는 데이터를 성공적으로 분석할 수 없을 것이다. 수동 카운팅 또는 임계값과 같은 기법은 분석이 단일 파라미터로 구성되거나 여러 마커가 중첩 신호만 카운팅되는 동일한 국소화를 갖는 경우에만 실행 가능합니다. 이러한 제한으로 인해 기존 분석은 매개 변수가 높은 데이터 세트로 작업하기에 적합하지 않습니다. 이러한 데이터 세트의 성공적인 분석은 조직학 이미지에서 단일 세포를 분할한 다음 세포 유형을 식별하기 위해 유세포 분석과 같은 게이팅 전략을 수행함으로써 달성되었습니다16,17. 그러나 이러한 분석에 영향을 미치는 또 다른 문제는 이러한 기술이 물리적으로 접촉하는 세포를 정확하게 분리할 수 있는 방법을 사용하지 않기 때문에 관심 있는 모든 셀이 물리적으로 서로 분리되어 있는 데이터 세트에서만 작동한다는 것입니다. 따라서, 세포가 물리적으로 접촉되어 있더라도 조직학 단면에 대한 단일 세포 분석을 수행할 수 있는 새로운 방법이 필요합니다.
이 기사에서는 이전에 소개된 histoflow cytometry라는 간단한 프로토콜에 대해 설명합니다.18 이 프로토콜은 널리 사용 가능한 현미경을 사용하여 동시에 이미징할 수 있는 형광 파라미터의 수를 확장합니다. 이 프로토콜은 스펙트럼적으로 겹치는 염료로 조직을 염색한 다음 스펙트럼 보정을 사용하여 겹치는 채널에서 블리드스루를 제거하여 선명한 단일 염색을 얻는 방식으로 작동합니다. 고파라미터 조직학 이미지의 분석을 용이하게 하기 위해, 유세포분석과 같은 게이팅 전략을 사용하여 세포를 별개의 집단으로 분류하기 위해 조직 절편에서 단일 세포를 추출하는 상세한 분석 파이프라인이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 세포가 확산되어 존재하는 조직과 세포가 밀접하게 압축된 조직에서 작동하므로 이 기술은 항상성 및 신경염증 모두에서 CNS와 같은 조직의 연구에 다재다능합니다. 따라서 Histoflow 유세포분석은 공간 정보를 유지하면서 세포를 정의하기 위해 여러 세포 마커가 필요한 복잡한 세포 유형 간의 상호 작용을 연구하는 데 유용한 기술입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 이전에 검증된 기술인 histoflow cytometry의 사용에 대해 설명합니다(18). 스펙트럼적으로 겹치는 염료로 조직 절편을 염색할 때 스펙트럼 보정을 사용하여 채널을 가로지르는 블리드스루를 제거할 수 있으며, 그 결과 기존 방법을 통해 일반적으로 가능한 것보다 더 많은 수의 형광 매개변수가 명확하게 분해될 수 있음이 입증되었습니다. 고파라미터 조직학 이미지는 기?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이미징 인프라와 전문 지식을 제공한 Hotchkiss Brain Institute Advanced Microscopy Platform에 감사드립니다. RWJ는 University of Calgary Eyes High 프로그램의 박사후 연구원 기금과 캐나다 다발성 경화증 학회 (Multiple Sclerosis Society of Canada) 및 Roche Canada 무제한 교육 펠로우십의 지원을 받았습니다. VWY는 Canada Research Chair Tier 1 프로그램에서 급여 지원을 받았습니다. 이 연구는 캐나다 보건원(Canadian Institutes of Health) 연구 보조금 1049959, 캐나다 다발성 경화증 학회(Multiple Sclerosis Society of Canada) 보조금 3236 및 미국 국방부(US Department of Defense of the Congressionally Directed Multiple Sclerosis Research Program)의 운영 자금으로 지원되었습니다. 그림 1 은 BioRender.com 로 작성되었습니다. 이 간행물에서 조정된 수치는 원래 The Journal of Immunology에 게재되었습니다. Rajiv W. Jain, David A. Elliott 및 V. Wee Yong. 2023. Histoflow Cytometry를 사용한 High-parameter Histology 이미지의 단일 세포 분석. J. 이뮤놀. 210: 2038-2049. 저작권 © [2023]. 미국 면역학자 협회(American Association of Immunologists, Inc.)
Materials
| 100% Ethanol | Sigma | 676829-1L | |
| 4% PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | https://www.anaconda.com/download |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4503-50G | |
| Cold fish stain gelatin | Sigma | G7765 | |
| Collating multichannel data from Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | 1:300 concentration |
| Donkey anti-rat DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | 1:200 concentration |
| Donkey Serum | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | 1:25 concentration |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software 4 | |
| Fluorescence spectraviewer | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Fresh frozen human tonsil sections | amsbio | HF-707 | |
| Glass coverslip | VWR | 48393 106 | |
| Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgG Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgM Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | 1:300 concentration |
| Goat anti-rabbit A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | 1:250 concentration |
| Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | 1:250 concentration |
| Horse Serum | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/ |
| Ilastik FIJI plugin | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | Software 2 | |
| Imaris with cell module | Oxford Instruments | Software 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX Life Science software | Leica | Software 1 | |
| Mouse anti-human CD20 | VWR | CA95024-322 | 1:40 concentration |
| Mouse anti-human CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 concentration |
| Normal Goat Serum | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Normal Mouse Serum | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| Normal Rabbit Serum | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| Normal Rat Serum | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| Nuclear Yellow | Abcam | ab138903 | Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark |
| PAP pen | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Rabbit anti-human Ki67 | Abcam | ab15580 | 1:500 concentration |
| Rabbit anti-mouse Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:500 concentration |
| Rat anti-human Blimp1 | Thermofisher | 14-5963-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | 1:250 concentration |
| Rat anti-mouse CD138 | Biolegend | 142502 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700 | BD Biosciences | 565478 | 1:50 concentration |
| Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | 1:50 concentration |
| SP8 Confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
References
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