Élucidation des propriétés physicochimiques de la #946 ;-1,3-glucanase et de la peroxydase du mécanisme de défense de la paroi cellulaire du blé contre l’infestation par Diuraphis noxia

Résumé

Le présent protocole décrit les procédures utilisées pour étudier et caractériser les enzymes liées à la paroi cellulaire, principalement la β-1,3-glucanase et la peroxydase, chez les plants de blé. Leurs niveaux d’activité augmentent lors de l’interaction blé-RWA et sont impliqués dans la réponse de défense des plantes par le renforcement de la paroi cellulaire, ce qui dissuade l’alimentation des pucerons.

Résumé

Les plants de blé infestés par des pucerons russes du blé (RWA) induisent une cascade de réponses de défense, y compris les réponses d’hypersensibilité (HR) et l’induction de protéines liées à la pathogenèse (PR), telles que la β-1,3-glucanase et la peroxydase (POD). Cette étude vise à caractériser les propriétés physicochimiques de la POD et de la β-1,3-glucanase associées à la paroi cellulaire et à déterminer leur synergie sur la modification de la paroi cellulaire lors de l’interaction RWASA2-blé. Les cultivars sensibles Tugela, Tugela-Dn1 modérément résistant et Tugela-Dn5 résistant ont été prégermés et plantés en serre, fertilisés 14 jours après la plantation et irrigués tous les 3 jours. Les plantes ont été infestées de 20 individus parthénogénétiques du même clone RWASA2 au stade 3 feuilles, et les feuilles ont été récoltées 1 à 14 jours après l’infestation. Le liquide de lavage intercellulaire (IWF) a été extrait par filtration sous vide et stocké à -20 °C. Les résidus foliaires ont été broyés en poudre et utilisés pour les composants de la paroi cellulaire. L’activité et la caractérisation du POD ont été déterminées à l’aide d’un substrat de gaïacol de 5 mM et de H₂O₂, en surveillant la variation de l’absorbance à 470 nm. L’activité de la β-1,3-glucanase, le pH et les conditions optimales de température ont été démontrés en mesurant les sucres réducteurs totaux dans l’hydrolysat avec le réactif DNS à l’aide de substrats β-1,3-glucane et β-1,3-1,4-glucane, en mesurant l’absorbance à 540 nm et en utilisant la courbe étalon du glucose. Le pH optimal a été déterminé entre 4 et 9, la température optimale entre 25 et 50 °C et la stabilité thermique entre 30 °C et 70 °C. La spécificité du substrat de β-1,3-glucanase a été déterminée à 25 °C et 40 °C à l’aide de substrats de β-1,3-1,4-glucane de curdlan et d’orge. De plus, le mode d’action de la β-1,3-glucanase a été déterminé à l’aide de la laminaribiose à la laminaripentaose. Les profils de produits d’hydrolyse des oligosaccharides ont été analysés qualitativement par chromatographie sur couche mince (CCM) et quantitativement par HPLC. La méthode présentée dans cette étude démontre une approche robuste pour infester le blé avec des actifs pondérés en roturier la rose, extraire la peroxydase et la β-1,3-glucanase de la région de la paroi cellulaire et leur caractérisation biochimique complète.

Introduction

Les pucerons russes du blé infestent le blé et l’orge, causant des pertes de rendement importantes ou une réduction de la qualité des grains. Le blé réagit à l’infestation en induisant plusieurs réponses de défense, notamment l’augmentation des niveaux d’activité de la β-1,3-glucanase et de la peroxydase chez les cultivars résistants, tandis que les cultivars sensibles réduisent l’activité de ces enzymes au début de la période d’infestation 1,2,3,4. Les principales fonctions de la β-1,3-glucanase et du POD dans la plante de blé comprenaient....

Protocole

L’étude a été menée avec l’approbation et la permission du Comité d’éthique de la recherche sur l’environnement et la biosécurité de l’Université de l’État libre (UFS-ESD2022/0131/22). Les détails des réactifs et de l’équipement ici sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Conditions de croissance des plantes

1. Faites germer 250 graines de chaque cultivar de blé, c’est-à-dire Tugela, Tugela-Dn1 sensible, Tugela-Dn1 modérément résistant et Tugela-Dn5 résistant, dans des boîtes de Pétri séparées.
2. Ajoutez 5 ml d’eau distillée dans chaque boîte de Pétri, scellez-la av....

Résultats

Quatre réplicats biologiques de cultivars de blé (Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5) ont été infestés par RWASA2 au stade de croissance à 3 feuilles. Après l’infestation, les feuilles ont été récoltées à 1-, 2-, 3-, 7-, 14 dpi. Les traitements témoins n’ont pas été infestés par RWASA2 pour rendre les résultats de l’expérience comparables à ceux des plants de blé non exposés au stress. Les expériences ont été menées en quadrilcalitats, et les résultats ont été présentés sous forme de valeurs moyennes.

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Discussion

Le blé et l’orge sont des cultures céréalières fréquemment infestées par des espèces de pucerons, y compris les pucerons russes du blé (Diuraphis noxia)^7,24. Les plants de blé résistants induisent la régulation positive des activités POD et β-1,3-glucanase en tant que réponses de défense tout au long de la période d’infestation pour modifier la paroi cellulaire en régulant l’accumulation de callose et de lignine

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Centrifugeuse à membrane concentratrice de 10 kDa	Sigma-Aldrich	R1NB84206	À usage scientifique uniquement. Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic. Pour la concentration et la purification de solutions biologiques.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Irlande)	O-LAM2	Laminaribiose de haute pureté pour la recherche, les dosages d’enzymes biochimiques et l’analyse diagnostique in vitro.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Irlande)	O-LAM3	Laminaritriose de haute pureté pour la recherche, les tests d’enzymes biochimiques et l’analyse diagnostique in vitro.
Acide 3,5 dinitrosalicylique	Sigma-Aldrich	D0550	Utilisé dans la détermination colorimétrique des sucres réducteurs
4 g de laminaritétraose  ;	Megazyme (Wicklow, Irlande)	O-LAM4	Laminaritétraose de haute pureté pour la recherche, les dosages biochimiques d’enzymes et l’analyse diagnostique in vitro.
5 g de Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Irlande)	O-LAM5	Laminaripentaose de haute pureté pour la recherche, les dosages biochimiques d’enzymes et l’analyse diagnostique in vitro.
Éthanol absolu à 95 %	Sigma-Aldrich	107017	Absolu d’éthanol pour l’analyse
l’acide acétique	Sigma-Aldrich	B00063	Acide acetc glacial 100 % pour l’analyse (contient de l’acide acétique)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Irlande)	S-ACMC	Le polysaccharide est teint avec du Remazolbrilliant Blue R à raison d’environ une molécule de colorant pour 20 résidus de sucre.
Bêta-glucane (orge)  ;	Megazyme (Wicklow, Irlande)	G6513	Un substrat en poudre, moins soluble dans l’eau. Utilisé pour déterminer l’activité de la &bêta ;-1,3-glucanase.
Colorant d’essai de protéines Bio-Rad	Bio-Rad Laboratories, Afrique du Sud	500-0006	Colorant d’essai colorimétrique, concentré, à utiliser avec les kits d’analyse de protéines Bio-Rad I et II  ;
Albumine sérique bovine (BSA)	Gibco Europe	810-1018	Pour usage en laboratoire uniquement
Acide citrate	Sigma-Aldrich	C0759	Pour la recherche en sciences de la vie uniquement. Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic.
CM-curdlan  ;	Megazyme (Wicklow, Irlande)	P-CMCUR	Substrat en poudre pour la détermination de l’activité de la &bêta ;-1,3-glucanase. Insoluble dans l’eau.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Pour la recherche en sciences de la vie uniquement. Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Indicateur d’oxydation. Utilisé pour déterminer l’activité de la peroxydase.
Peroxyde d’hydrogène	BDH Laboratory Supplies, Angleterre	10366	Puissant agent oxydant.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonie)	NI	Substrat de semis à base de tourbe.
Engrais Multifeed (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	Un engrais soluble dans l’eau pour les jeunes plantes en développement et les semis ayant un besoin élevé en phosphore (P) afin d’assurer un développement racinaire optimal.
Naphtol	Merck, Allemagne	N2780	Subit des hydrogénations en présence d’un catalyseur.
Phénol	Sigma-Aldrich	33517	Sensible à la lumière. Pour R& D d’utilisation uniquement. Ne pas utiliser à des fins médicamenteuses, domestiques ou autres. Tartrate
de sodium de potassium tétrahydraté (sel de Rochelle)	Sigma-Aldrich	S2377	utilisé dans la préparation de la solution d’acide 3,5-dinitrosalicylique utilisée dans le dosage du sucre réducteur.
Plaque de silice (TLC Gel de silice 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Matrice de gel de silice, avec indicateur fluorescent 254 nm
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	S8045	Pour R& D d’utilisation uniquement. Ne pas utiliser à des fins médicamenteuses, domestiques ou autres.
Métabisulfite de sodium	Sigma-Aldrich	31448	Ajouté en tant qu’antioxydant lors de la préparation de solutions d’acide 3,5-dinitrosalicylique.
Phosphate de sodium dibasique heptahydraté	Sigma-Aldrich	S9390	Utilisé comme solution tampon dans la recherche biologique pour maintenir le pH constant.
Phosphate de sodium heptahydraté monobasique	Sigma-Aldrich	71500	Un composé inorganique, soluble dans l’eau. Utilisé comme réactif dans le développement de coulis à base de silicate.
Logiciel d’analyse statistique	TIBCO Statistica	version 13.1
Acide sulfurique	Merck, Darmstadt, Allemagne	30743	Acide sulfurique 95-97 % pour l’analyse du Hg, réactif ACS.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Agent tampon dans les mélanges d’incubation. Il a également été utilisé comme composant de la lyse et du tampon TE (Tris-EDTA). Pour la recherche en sciences de la vie uniquement. Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic.
UV&ndash ; Spectrophotomètre visible	GENESYS 120  ;
; NI = non identifié.

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