我们描述了一个准备DNA涂金子弹的方法,并展示了使用这种子弹biolistically转染培养的海马神经元。
基因枪法转的转高速DNA包覆颗粒轰击组织细胞的物质手段。我们提供了详细的基因枪转染大鼠海马脑片的协议,从DNA包覆子弹的前期准备工作,以最终拍摄使用基因枪的器官切片文化。基因枪转染,转染神经元的高效和便捷的手段和荧光标记的细胞组织切片中的一小部分是特别有用。在这段视频中,我们首先轮廓大衣金粒子与DNA所需的步骤。接下来我们演示如何行与金/ DNA子弹的塑料管内,以及如何削减油管获得加载到基因枪的塑料墨盒。最后,我们进行基因枪转染大鼠海马脑片培养,显示处理Bio – Rad公司赫利俄斯基因枪,并提供故障排除的意见,以获得健康的最佳转的组织切片。
基因枪法转高速DNA涂金粒子轰击与活体组织细胞的转染通过物理手段。在粒子介导的基因转移,导致在一般的转染细胞时,在细胞核中的子弹来休息。尽管存在许多不同的转染方法,如显微注射法,脂质体转染,转染钙磷,电和病毒转染,基因枪转染可以提供劳动密集,转染细胞是不容易转用其他方法和有效的替代方案。事实上,这是首次在植物基因转移技术开发使用预先存在的方法1由于细胞壁的存在,所以很难作出转。同样,biolistics已经获得了在神经生物学领域的普及,因为有丝分裂后神经元是出了名的难以转染2,3。特别是,它是举世公认的原则,技术被用于实验旨在评估完整的脑切片中的单个神经元的罚款形态。这里所描述的方法提供了详尽和全面的解释如何使用基因枪举行的手(的Helios基因枪系统; Bio – Rad公司)进行基因枪转染培养的脑切片。
基因枪转染已成为转染片文化中的神经元的首选方法,因为它允许稀疏数量的整个大脑切片的细胞转染。这样,单个神经元可在隔离审查。由于这种技术特别适合转脑片神经元,它往往是使用双光子显微镜结合,使双光子激发荧光标记的细胞内光散射组织 4深的可视化以来。事实上,整个视频中的单锥体神经元的高倍率图像使用一个定制的双光子激光扫描显微镜被抓获。结论基因枪转是转染单个细胞内的一个细胞周围的高密度的背景下的有效手段,这种已被证明非常有用的荧光标签的单个神经元的神经切片文化。
我们愿与收购在本视频中的整个海马低倍率图像的帮助,感谢马克Lucanic,郑怀钟。我们还要感谢莎拉帕里什帮助伴随视频的文本。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
1.6um gold particles (microcarrier) | 0.25g | Bio-Rad | 1652264 | |
1M CaCl2 | Fluka | 21115 | ||
100% EtOH | 1pint | Gold shield | ||
Cartridge Tubing | Bio-Rad | 1652412 | ||
Scintillation vials | 20ml, 500/case | VWR | 66021-668 | |
Dessication pellets | “Dricap” | MTI (800-445-9890) | ||
Water bath sonicator | model 50T | VWR | ||
Cartridge holder | pack of 5 | Bio-Rad | 1652426 | |
Barrel liner | pack of 5 | Bio-Rad | 1652417 | |
Diffuser screen | pack of 5 | Bio-Rad | 1652475 | |
O-ring | 75 Viton, Size 007, Qty, 100 | McMaster-Carr | ||
Screen (mesh) | McMaster-Carr | 144258 | ||
PVP | 20mg/ml in EtOH | Bio-Rad | Comes with tubing from biorad | |
Tubing prep station | Bio-Rad | 1652418 | ||
Tubing cutter | Bio-Rad | 1652422 | ||
Helios Gene-Gun | Bio-Rad | 1652411 | ||
Gene gun hose | Bio-Rad | Comes with Gene-Gun | ||
Spermidine | 5g | Sigma | s-0266 |