Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Summary

Dieses Video zeigt Techniken für die Kennzeichnung von menschlichen embryonalen Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Technik kann für eine in vivo Verfolgung der transplantierten Stammzellen mit optischen Bildgebung und zur histopathologischen Korrelation mit Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden.

Abstract

Optical Imaging (OI) ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Werkzeug zur In-vivo-Überwachung der neuen Stammzell-basierten Therapien. Die Technik basiert auf ex vivo-Markierung von Stammzellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff, anschließende intravenöse Injektion der markierten Zellen und Visualisierung ihrer Anreicherung in bestimmten Zielorganen oder Pathologien basiert. Die vorgestellte Technik zeigt, wie wir von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) Etikett durch einfache Inkubation mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff DiD (C67H103CIN2O3S) und wie wir humanen embryonalen Stammzellen (hES) Etikett mit der FDA zugelassen Fluoreszenzfarbstoff Indocyaningrün (ICG). Die Aufnahme-Mechanismus erfolgt über die Einhaltung und Verbreitung der lipophilen Farbstoff in die Phospholipid-Doppelschicht der Zellmembran. Die Kennzeichnung Effizienz ist in der Regel verbessert werden, wenn die Zellen mit dem Farbstoff in serum-freien Medien als der Inkubation in Serum-haltigen Medien Gegensatz bebrütet werden. Darüber hinaus ist der Zusatz des Transfektionsagens Protaminsulfat deutlich verbessert Kontrastmittelaufnahme.

Protocol

Kennzeichnung von mesenchymalen Stammzellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff DiD Zu Beginn des Verfahrens zur Kennzeichnung mesenchymale Stammzellen, trypsinize und zählen Sie die Zellen, um eine Suspension mit einer definierten Anzahl von Zellen erhalten. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und saugen aus alten Medien von den Flaschen mit den Zellen markiert werden Waschen Sie die Zellen mit 10 ml Mg / Ca-freiem PBS. Saugen Sie die PBS. Die Mg-und Ca würde hemmen die Trypsin, desha…

Discussion

OI ist ein relativ neues bildgebendes Verfahren, basierend auf der Detektion von Fluoreszenz. OI ist so sensibel wie Radiotracer-basierten Imaging-Techniken, aber nicht mit einer Bestrahlung Exposition verbunden. OI stellt ein wirksames Mittel zur Verfolgung Zellen nicht-invasiv und wiederholt damit einen Einblick in die Zellwanderung an den Zielort. Eine wichtige Einschränkung der Technik ist die begrenzte Eindringen in das Gewebe von fluoreszierenden Sonden in vivo. So ein Tracer Akkumulation im tiefen Gewebe, mehr als etwa 5-10 cm von d…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Indocyanine Green (IR-125)	Reagent	Fisher Scientific	AC41254-1000
DMSO	Reagent	Sigma	D-2650
D-MEM High Glucose	Reagent	Sigma	D5648
Gelatin	Reagent	Sigma	G1890	Dilute to final concentration of 0.1% in PBS
PBS, Mg and Ca free	Reagent	GIBCO	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%	Reagent	Invitrogen	25300-120
Trypsin-EDTA 0.25%	Reagent	Invitrogen	25200-114
FCS, characterized	Reagent	Hyclone	SH30071.03
Cell Strainer (40 μm Nylon)	Reagent	BD Falcon	352340
DiD	Reagent	Molecular Probes	V-22887
Knockout DMEM	Reagent	GIBCO	10829018
Knockout Serum Replacer	Reagent	GIBCO	10828028
b-Mercaptoethanol	Reagent	Sigma	7522
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO	11140050
FGF-2	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Glutamine 200mM	Reagent	GIBCO	25030081
Penicillin/Streptomycin	Reagent	GIBCO	15140-122
Protamine Sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners Inc.