Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin
Summary
Proteiner som binder till fintrådiga aktin (F-aktin) genom distinkta aktin bindande moduler. I denna video visar vi förfarandet med aktin samarbete sedimentering, vilket är ett in vitro-test rutinmässigt används för att analysera proteiner eller specifika områden som binder F-aktin.
Abstract
Den aktin cytoskelettet i cellen är ett nätverk av aktin filament som tillåter förflyttning av celler och cellulära processer, och som genererar spänningar och hjälper upprätthåller cellulära form. Även aktin cytoskelettet är en styv konstruktion, det är en dynamisk struktur som ständigt remodeling. Ett antal proteiner kan binda till aktin cytoskelettet. Bindningen av ett visst protein till F-aktin är ofta önskat att stödja cellbiologiska observationer eller att ytterligare förstå dynamiska processer på grund av ombyggnad av aktin cytoskelettet. Actin co-sedimentering analysen är ett in vitro-test rutinmässigt används för att analysera bindning av specifika proteiner eller domäner protein med F-aktin. De grundläggande principerna för analysen innebär en inkubationstid av proteinet av intresse (full längd eller domän) med F-aktin, ultracentrifugering steg till pellets F-aktin och analys av proteinet tillsammans sedimenterande med F-aktin. Aktin samarbete sedimentering analyser kan utformas därför för att mäta aktin bindande tillhörighet och i analyser konkurrens.
Protocol
Discussion
Aktin samarbete sedimentering är ett enkelt in vitro-analys för att analysera specfic proteiner binder till F-aktin. I denna video visar vi ett exempel på hur en enkel aktin samarbete sedimentering kan ske. Vi visar hur man förbereder F-aktin, förbereda det protein som ska testas och det förfarande av aktin co-sedimentering. Ett antal punkter bör beaktas vid utförandet av aktin samarbete sedimentering analyser. Till exempel kan bufferten komponenter för odling varierar beroende på det protein som ska testas och pH, temperatu…
Acknowledgements
Tack till Dr Praveen Kumar i Wittman labbet vid UCSF för filmen av aktin i HaCAT celler.
References
- Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin. Biochimie. 14, 15418-15428 (2004).
- Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength. Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).
- Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain. J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).
