Localisé ARNi et l'expression des gènes extra-utérine dans la sangsue médicinale
Summary
Dans cette vidéo, nous montrons une procédure pour une livraison précise biolistique des réactifs dans le tissu vivre avec un canon à gènes miniatures roman. Nous sommes renversant l'expression de la nétrine axone molécule conseils dans les embryons de sangsue en fournissant des molécules d'ARN double brin dans le mur ventrale du corps et les ganglions des segments unique.
Abstract
Dans cette vidéo, nous montrons l'utilisation d'un pistolet pneumatique capillaires pour la livraison précise biolistique des réactifs dans les tissus vivants. Nous utilisons la procédure à des modèles de perturber l'expression des gènes dans des segments choisis d'embryons de sangsue, laissant les segments non traitées comme des contrôles internes.
Le pistolet pneumatique capillaire peut être utilisée pour atteindre les couches internes de cellules à des stades précoces du développement, sans ouvrir le spécimen. En tant que méthode pour l'introduction de substances dans localisée des tissus vivants, de la délivrance biolistique avec le pistolet a plusieurs avantages: il est rapide, sans contact et non destructive. En outre, une seule arme capillaire peut être utilisée pour la livraison indépendant de différentes substances. La région de livraison peuvent avoir des dimensions latérales de ~ 50 à 150 um et s'étend sur environ 15 um autour de la profondeur de pénétration moyenne, qui est réglable entre 0 et 50 um. Cette livraison a l'avantage d'être en mesure de cibler un nombre limité de cellules dans un endroit choisi intermédiaire entre cellule unique renverser par microinjection et démontable par des injections systémiques extracellulaire ou par des approches génétiques.
Pour faire tomber ou de frapper dans l'expression de la nétrine axone molécule orientation, qui est naturellement exprimé par certains neurones centraux et dans la paroi ventrale du corps, mais pas le domaine dorsale, nous délivrer des molécules d'ARN double brin ou ADN plasmidique dans la paroi du corps et ganglions centraux. Cette procédure comprend les étapes suivantes: (i) la préparation du dispositif expérimental pour un dosage précis (ajustement de la pression d'accélération), (ii) l'enrobage des particules avec des molécules d'ARN double brin ou d'ADN, (iii) de chargement des particules enrobées dans le pistolet, jusqu'à deux réactifs dans un essai, (iv) la préparation des animaux pour la livraison des particules, (v) la livraison de particules enrobées dans le tissu cible (paroi du corps ou des ganglions), et (vi) le traitement des embryons (immunomarquage, l'immunohistochimie et neuronale étiquetage) pour visualiser les résultats, généralement de 2 à 3 jours après la livraison.
Lorsque les particules ont été revêtus de la nétrine ARNdb, ils ont causé bien visible le knock-down de l'expression nétrine que seulement eu lieu dans des cellules contenant des particules (généralement, 1-2 particules par cellule). Particules enrobées avec un encodage de fluorescence EGFP plasmide induite dans les cellules neuronales quand ils ont cessé dans leurs noyaux.
Protocol
Discussion
Dans cette démonstration, nous avons utilisé le pistolet pneumatique capillaires pour fournir des particules d'or dans les cellules localisées dans le volume des petits un embryon vivant sangsue à knock-in et knock-down gènes. La région cible ont généralement un diamètre de ~ 150 um et les particules ont été trouvés ~ 15 um autour de la profondeur de pénétration moyenne, qui était réglable entre 0 et 50 um. Lorsque les particules ont été recouvertes de molécules ARN double brin de l'axone nétrine facteur de guida…
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Michael Baker pour son aide dans la génération des constructions pour le gène knock-in et de fournir les films en accéléré de la croissance des projections sensorielles. Nous tenons également à remercier la Virginie Vandelinder d'assistance technique avec les expériences pistolet pneumatique.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
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