Localizada RNAi e Expressão Gênica ectópica na sanguessuga medicinal
Summary
Neste vídeo, mostramos um procedimento para uma entrega precisa biobalística de reagentes em tecido vivo com uma arma gene romance em miniatura. Estamos derrubando a expressão da molécula de orientação netrin axônio em embriões de sanguessuga, fornecendo moléculas de dsRNA na parede ventral do corpo e gânglios dos segmentos individuais.
Abstract
Neste vídeo, mostramos o uso de uma pistola pneumática capilar para a entrega precisa biobalística de reagentes em tecido vivo. Nós usamos o procedimento de padrões de expressão gênica perturb em segmentos selecionados de embriões sanguessuga, deixando os segmentos não tratados como controles internos.
A pistola pneumática capilar pode ser utilizada para atingir camadas internas de células em estágios iniciais de desenvolvimento sem abrir o espécime. Como um método para a introdução de substâncias localizadas em tecidos vivos, a entrega biobalística com a arma tem várias vantagens: é rápido, sem contato e não-destrutivos. Além disso, uma arma única capilar pode ser utilizado para a entrega independente de substâncias diferentes. A região de entrega pode ter dimensões laterais de ~ 50-150 mm e se estende por ~ 15 mm em torno da profundidade de penetração média, que é ajustável entre 0 e 50 mm. Esta entrega tem a vantagem de ser capaz de atingir um número limitado de células em um local selecionado intermediário entre célula única derrubar por microinjeção e knockdown sistêmica através de injeções extracelular ou por meio de abordagens genéticas.
Para derrubar ou bater na expressão da molécula de orientação netrin axônio, que é naturalmente expresso por alguns neurônios centrais e na parede ventral do corpo, mas não o domínio do dorsal, nós entregamos moléculas de dsRNA ou DNA-plasmídeo na parede do corpo e gânglios central. Este procedimento inclui as seguintes etapas: (i) preparação da montagem experimental para um teste específico (ajustando a pressão de aceleração), (ii) revestimento das partículas com as moléculas de dsRNA ou DNA, (iii) o carregamento das partículas revestido na arma, até dois reagentes em um ensaio, (iv) preparar os animais para a entrega de partículas, (v) a entrega de partículas revestidas no tecido alvo (parede do corpo ou gânglios), e (vi) o tratamento dos embriões (imunohistoquímica de positividade, e neuronal rotulagem) para visualizar os resultados, geralmente 2 a 3 dias após o parto.
Quando as partículas foram revestidas com netrin dsRNA, que causaram claramente visível knock-down de netrin expressão que só ocorreu em células contendo partículas (geralmente, 1-2 partículas por célula). Partículas revestidas com uma codificação de fluorescência EGFP plasmídeo induzida em células neuronais quando pararam em seus núcleos.
Protocol
Discussion
Nesta demonstração, utilizamos a pistola pneumática capilar para entregar partículas de ouro em células localizadas no volume pequeno de um embrião vivo para sanguessuga knock-in e knock-down genes. A região-alvo, geralmente tinha um diâmetro de ~ 150 mm e partículas foram encontrados ~ 15 mm em torno da profundidade de penetração média, que era ajustável entre 0 e 50 mm. Quando as partículas foram revestidos com moléculas de dsRNA do netrin fator de orientação axônio, eles causaram claramente visível knock-down de netrin…
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Michael Baker pela sua ajuda na geração de construções para gene knock-in e por fornecer os filmes de lapso de tempo de crescer projeções sensoriais. Gostaríamos também de agradecer a Virginia Vandelinder de assistência técnica com os experimentos pistola pneumática.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
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