Neste vídeo, mostramos um procedimento para uma entrega precisa biobalística de reagentes em tecido vivo com uma arma gene romance em miniatura. Estamos derrubando a expressão da molécula de orientação netrin axônio em embriões de sanguessuga, fornecendo moléculas de dsRNA na parede ventral do corpo e gânglios dos segmentos individuais.
Neste vídeo, mostramos o uso de uma pistola pneumática capilar para a entrega precisa biobalística de reagentes em tecido vivo. Nós usamos o procedimento de padrões de expressão gênica perturb em segmentos selecionados de embriões sanguessuga, deixando os segmentos não tratados como controles internos.
A pistola pneumática capilar pode ser utilizada para atingir camadas internas de células em estágios iniciais de desenvolvimento sem abrir o espécime. Como um método para a introdução de substâncias localizadas em tecidos vivos, a entrega biobalística com a arma tem várias vantagens: é rápido, sem contato e não-destrutivos. Além disso, uma arma única capilar pode ser utilizado para a entrega independente de substâncias diferentes. A região de entrega pode ter dimensões laterais de ~ 50-150 mm e se estende por ~ 15 mm em torno da profundidade de penetração média, que é ajustável entre 0 e 50 mm. Esta entrega tem a vantagem de ser capaz de atingir um número limitado de células em um local selecionado intermediário entre célula única derrubar por microinjeção e knockdown sistêmica através de injeções extracelular ou por meio de abordagens genéticas.
Para derrubar ou bater na expressão da molécula de orientação netrin axônio, que é naturalmente expresso por alguns neurônios centrais e na parede ventral do corpo, mas não o domínio do dorsal, nós entregamos moléculas de dsRNA ou DNA-plasmídeo na parede do corpo e gânglios central. Este procedimento inclui as seguintes etapas: (i) preparação da montagem experimental para um teste específico (ajustando a pressão de aceleração), (ii) revestimento das partículas com as moléculas de dsRNA ou DNA, (iii) o carregamento das partículas revestido na arma, até dois reagentes em um ensaio, (iv) preparar os animais para a entrega de partículas, (v) a entrega de partículas revestidas no tecido alvo (parede do corpo ou gânglios), e (vi) o tratamento dos embriões (imunohistoquímica de positividade, e neuronal rotulagem) para visualizar os resultados, geralmente 2 a 3 dias após o parto.
Quando as partículas foram revestidas com netrin dsRNA, que causaram claramente visível knock-down de netrin expressão que só ocorreu em células contendo partículas (geralmente, 1-2 partículas por célula). Partículas revestidas com uma codificação de fluorescência EGFP plasmídeo induzida em células neuronais quando pararam em seus núcleos.
Nesta demonstração, utilizamos a pistola pneumática capilar para entregar partículas de ouro em células localizadas no volume pequeno de um embrião vivo para sanguessuga knock-in e knock-down genes. A região-alvo, geralmente tinha um diâmetro de ~ 150 mm e partículas foram encontrados ~ 15 mm em torno da profundidade de penetração média, que era ajustável entre 0 e 50 mm. Quando as partículas foram revestidos com moléculas de dsRNA do netrin fator de orientação axônio, eles causaram claramente visível knock-down de netrin…
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Michael Baker pela sua ajuda na geração de construções para gene knock-in e por fornecer os filmes de lapso de tempo de crescer projeções sensoriais. Gostaríamos também de agradecer a Virginia Vandelinder de assistência técnica com os experimentos pistola pneumática.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |