Le protocole texte complet de cette approche expérimentale est disponible en <a class="jove_content" href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract">Current Protocols in Cell Biology.</a>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

congélation, la décongélation, et les cellules d&#39;emballage pour les transports

Cellules de mammifères cultivées sont largement utilisés dans les études de biologie cellulaire. Elle nécessite un certain nombre de compétences particulières pour être en mesure de préserver la structure, la fonction, le comportement et la biologie des cellules en culture. Cette vidéo décrit les compétences de base requises pour congeler et conserver les cellules et comment faire pour récupérer les stocks de surgelés.

Cellules de mammifères cultivées sont largement utilisés dans les études de biologie cellulaire. Cette vidéo décrit les compétences de base requises pour congeler et conserver les cellules et comment faire pour récupérer les stocks de surgelés.

Congélation, la décongélation, et les cellules d&#39;emballage pour les transports

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Les cultures cellulaires sont utilisées dans une grande variété d’applications de recherche et de diagnostic. Il est parfois souhaitable de stocker des lignées cellulaires pour des travaux futurs afin de préserver les cellules, d’éviter la sénescence, de réduire le risque de contamination et de minimiser les effets de la dérive génétique. Les lignées cellulaires peuvent être congelées pour un stockage à long terme.Dans cette vidéo, nous vous montrons comment congeler des cellules cultivées à la fois en monocouche et en suspension, et comment les décongeler pour les faire pousser à nouveau. Bonjour, je suis Ricky ici dans le laboratoire du Dr.LAN au Molecular Pathology Laboratories Network dans l’est du Tennessee. Aujourd’hui, je vais vous montrer comment congeler des cellules pour un stockage à long terme et comment les décongeler à partir d’azote liquide.Pour congeler les cellules d’adhérence humaine, vous commencez par les retirer de la plaque comme vous le feriez si vous les emballiez. Gardez à l’esprit qu’il est préférable d’utiliser des cellules qui sont dans leur phase logarithmique de croissance pour la cryo-conservation. Une fois que les cellules se sont détachées et que vous avez arrêté la réaction de tripsin en ajoutant du sérum ou un milieu contenant du sérum, transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger stérile et ajoutez deux moulins.Un milieu complet avec des cellules sériques provenant de trois boîtes ou plus de la même sous-culture de la même source peut être combiné en un seul tube. La centrifugeuse est constituée de cellules pendant cinq minutes à 300 à 350 G à température ambiante. Après l’essorage, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension à 10 mils de quatre degrés Celsius.Complétez le milieu, ajoutez un volume égal de quatre degrés de milieu de congélation, mélangez soigneusement les cellules, puis placez le tube sur des cellules de comptage de glace. À l’aide d’un hémocytomètre, diluez la suspension avec plus de fluide de congélation afin d’obtenir une concentration cellulaire finale de 1 million ou 10 millions de cellules par millilitre pour congeler les cellules d’un flacon presque confluent de 25 centimètres carrés. Resus suspension dans environ trois mils de milieu de congélation pipette un mil aliquotes de suspension cellulaire dans des flacons cryogéniques de deux mil étiquetés.Assurez-vous de serrer les bouchons des flacons. Placez les flacons une heure à toute la nuit dans un congélateur à moins 80, puis transférez-les dans un congélateur à stockage d’azote liquide. La congélation de cellules issues d’une culture en suspension est similaire en principe à la congélation de cellules d’une monocouche.La principale différence est que les cultures en suspension n’ont pas besoin d’être des tryps. Inized first, transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et tournez pendant 10 minutes à 300 à 350 G à température ambiante. Ensuite, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension à quatre degrés, en congelant le milieu à une densité de 1 à 10 millions de cellules par mil.Transférez ensuite un million d’aliquotes de suspension cellulaire dans des flacons cryogéniques et congelez-les. Comme cela a été fait pour les cultures monocouches, dont il a été démontré dans le chapitre précédent pour décongeler et récupérer les flacons congelés. Tout d’abord, retirez le flacon de cellules du congélateur à l’azote liquide et placez-le immédiatement dans un bain-marie à 37 degrés.Agitez le flacon en continu jusqu’à ce que le milieu soit décongelé, ce qui prend généralement moins de 60 secondes. Une fois décongelé, essuyez le haut du flacon avec de l’éthanol à 70 % avant de l’ouvrir. Transférez ensuite la suspension de cellules décongelées dans un tube de centrifugation stérile contenant deux mils de milieu complet chaud et une centrifugeuse de sérum bovin fœtal à 20 %.Ceci pendant 10 minutes à 150 à 200 Gs à température ambiante. Cette étape permettra d’éliminer tout DMSO résiduel après la centrifugation, de jeter le surnageant et de suspendre doucement la pastille cellulaire en petite quantité autour d’un mil de milieu complet et à 20 % de FBS, de la transférer dans une plaque de culture correctement étiquetée contenant la quantité appropriée de milieu. En général, un mil de suspension cellulaire est nécessaire dans cinq à 20 mils de milieu.Maintenant, vous pouvez mettre les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius pour qu’elles se développent après 24 heures. Vous voudrez vous assurer que les cellules se sont attachées à la plaque après cinq à sept jours, ou lorsque l’indicateur de pH du milieu change de couleur, vous voudrez changer de milieu. Vous voudrez conserver les cultures dans un milieu contenant 20 % de FBS jusqu’à ce que la lignée cellulaire soit rétablie.Si le taux de récupération est extrêmement faible, seule une sous-population de la culture d’origine peut croître. Soyez particulièrement prudent lorsque vous travaillez avec des lignées cellulaires connues pour être mosaïques. Si des cultures doivent être expédiées, cela peut être fait facilement pour les cultures monocouches et en suspension.Dans la culture tissulaire de 25 centimètres, les cellules des flacons sont cultivées jusqu’à une quasi-cofluence dans une monocouche ou à la densité souhaitée en suspension. Pour les cultures monocouches, le milieu est d’abord retiré, puis le ballon est rempli de milieu frais. Il est essentiel que le flak soit complètement rempli de milieu pour éviter que les cellules ne se dessèchent si les flacons sont retournés pendant le transport.Pour la suspension, des cultures, fraîches, du milieu est ajouté pour remplir le flacon. Le capuchon est serré et fixé en place à l’aide d’un parfum. Le flacon est scellé dans un sac en plastique étanche ou un autre récipient étanche conçu pour éviter les déversements.Dans le cas où la fiole serait endommagée, le conteneur primaire est ensuite placé dans un conteneur isotherme secondaire pour le protéger des températures extrêmes pendant le transport. Une étiquette de danger pour l’acheteur est apposée à l’extérieur de l’emballage. Généralement, les cultures sont transportées la même nuit ou la nuit. Courriers.Nous venons de vous montrer comment congeler et décongeler des cultures de cellules humaines pour les cellules adhérentes et en suspension. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans toutes vos expériences.

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Research

JoVE Journal

Biology

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Molecular Pathology Laboratory Network, Inc.  Cellules de mammifères cultivées sont largement utilisés dans les études de biologie cellulaire. Cette vidéo décrit les compétences de base requises pour congeler et conserver les cellules et comment faire pour récupérer les stocks de surgelés.

Congélation, la décongélation, et les cellules d'emballage pour les transports

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