全细胞记录的光在视网膜切片诱发兴奋性突触电流
Summary
录像显示，水产品虎蝾螈视网膜片全细胞电压钳记录的过程。我们示范片的准备，以及如何执行膜片钳记录在视网膜的视觉刺激。
Abstract
我们采用全细胞膜片钳技术，研究突触电路，基础在视网膜的视觉信息处理。在这段视频中，我们将引导您通过光诱发电流的单个细胞在视网膜切片准备执行的全细胞记录的过程中。我们使用的动物模型水产品虎蝾螈。我们首先描述了眼睛的解剖，并显示如何安装电生理记录片。一旦切片是在录音室中，我们将演示如何执行全细胞电压钳记录。然后，我们项目切片中的视觉刺激，引起光诱发的电流反应到的光感受器。在录制过程中，我们灌注与药理代理切片，即一个8声道的灌注系统，让我们之间快速切换不同的代理。在视网膜上，视网膜片制剂被广泛用于膜片钳记录，特别是研究无长突或双极细胞，这是在整个安装准备。
Protocol
解决方案神经节细胞的胞内解决方案（毫米）：100 K，葡萄糖酸钙，8氯化钾，氯化镁，1 EGTA，2，4 ATP，0.5的GTP，90微米Sulforhodamine B（染色），10 HEPES调节pH值= 7.4与氢氧化钾细胞内的解决方案，为双极细胞（毫米）：90 K -葡萄糖酸钙，1 8氯化钾， 氯化镁 2，10 BAPTA，10 HEPES，4个ATP的，0.5的GTP，90微米Sulforhodamine乙（染色），调整pH值= 7.4与氢氧化钾林格外的解决方?…
Discussion
优点：
- 所有类型的细胞都可以访问
- 类型的细胞容易识别，特别是如果一个荧光染料添加到电极解决方案
- 药理代理可以方便地到达靶细胞
- 膜片钳技术，允许在视网膜计算调查不同的离子通道的作用。不能得到相同的信息，通过胞穗录音或录音尖锐电极。
- 这种技术可以应用到其他的动物模型
缺点：
- 在切片过程中，进程可能会切断。因…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instruments | ||
| Lucivid | Microscope image injector | Mbf bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannfin corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | Milipore | HAWPO1300 | .45µm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan (Nashville, TN) |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
Tags
Whole-cell RecordingsLight Evoked Excitatory Synaptic CurrentsRetinal SliceWhole-cell Patch Clamp TechniqueVisual Information ProcessingRetinaAquatic Tiger SalamanderAnimal ModelEye DissectionElectrophysiological RecordingsRecording ChamberWhole-cell Voltage Clamp RecordingsVisual StimuliPhotoreceptorsLight-evoked Current ResponsesPharmacological Agents8-channel Perfusion SystemRetinal Slice PreparationPatch Clamp RecordingsAmacrine CellsBipolar Cells
Citer Cet Article
Werner, B., Cook, P. B., Passaglia, C. L. Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice. J. Vis. Exp. (17), e771, doi:10.3791/771 (2008).