Cette vidéo montre le processus de la cellule entière enregistrements pince de tension dans la tranche la rétine de la salamandre aquatique tigre. Nous démontrons la préparation de la tranche ainsi que la façon d'effectuer des enregistrements de patch-clamp pendant la stimulation visuelle de la rétine.
Abstract
Nous utilisons la technique de cellules entières patch clamp pour étudier les circuits synaptiques qui sous-tend le traitement des informations visuelles de la rétine. Dans cette vidéo, nous allons vous guider à travers le processus d'exécution de cellules entières d'enregistrements de la lumière des courants évoqués des cellules individuelles dans la préparation de tranches de la rétine. Nous utilisons la salamandre tigrée aquatiques comme un modèle animal. Nous commençons par décrire la dissection de l'oeil et de montrer comment les tranches sont montés pour des enregistrements électrophysiologiques. Une fois que la tranche est placée dans la chambre d'enregistrement, nous montrent comment effectuer la cellule entière enregistrements voltage. Nous avons ensuite projet de stimuli visuels sur les photorécepteurs de la tranche à susciter la lumière évoque les réponses actuelles. Pendant l'enregistrement, nous perfuser la tranche avec des agents pharmacologiques, par lequel un système de perfusion à 8 canaux nous permet de basculer rapidement entre les différents agents. La préparation de tranches rétiniennes est largement utilisé pour les enregistrements de patch-clamp dans la rétine, en particulier d'étudier ou de cellules amacrines bipolaire, qui ne sont pas accessibles dans une préparation toute monture.
Protocol
Solutions Solution intracellulaire des cellules ganglionnaires (en mm): 100 K-gluconate, 8 KCl, MgCl 1 2, 1 EGTA, HEPES 10, 4 ATP, GTP 0,5, 90 uM Sulforhodamine B (pour la coloration), ajusté à pH = 7,4 avec KOH Solution intracellulaire des cellules bipolaires (en mm): 90 K-gluconate, 8 KCl, MgCl 2 1, 10 BAPTA, HEPES 10, 4 ATP, GTP 0,5, 90 uM Sulforhodamine B (pour la coloration), ajusté à pH = 7,4 avec KOH Ringer extracellulaire de solution (en mM): 112 NaCl, glu…
Discussion
Avantages:
Tous les types de cellules sont accessibles
Identification aisée des différents types cellulaires, en particulier si un colorant fluorescent est ajouté à la solution d'électrode
Les agents pharmacologiques peuvent facilement atteindre les cellules cibles
La technique de patch-clamp permet d'étudier le rôle des canaux ioniques différentes dans les calculs de la rétine. La même information ne peut être obtenu grâce à des enregistrements ou des enregis…
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Multiclamp 700A
Patch Clamp Amplifier
Molecular Devices
SZX9
Dissection Micropscope
Olympus
BX50WI
Upright Microscope
Olympus
Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp
Werner, B., Cook, P. B., Passaglia, C. L. Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice. J. Vis. Exp. (17), e771, doi:10.3791/771 (2008).