Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben
Summary
Dieses Video zeigt den Prozess der whole-cell voltage clamp Aufnahmen in der Netzhaut Scheibe der aquatischen Tiger Salamander. Wir zeigen die Herstellung der Scheibe als auch, wie man Patch Clamp Messungen während visueller Stimulation der Netzhaut führen.
Abstract
Wir nutzen die whole-cell Patch-Clamp-Technik, um die synaptische Schaltungen, die zugrunde liegende visuelle Informationsverarbeitung in der Netzhaut zu untersuchen. In diesem Video werden wir Sie durch den Prozess der Durchführung Ganzzellableitungen des Lichts hervorgerufen Ströme der einzelnen Zellen in der Netzhaut schneiden Vorbereitung leiten. Wir nutzen die aquatische Tiger Salamander als Tiermodell. Wir von der Beschreibung der Dissektion des Auges beginnen und zeigen, wie Scheiben für elektrophysiologische Aufzeichnungen sind montiert. Sobald die Scheibe in der Aufnahme Kammer gegeben ist, zeigen wir, wie man whole-cell voltage clamp Aufnahmen durchzuführen. Wir projizieren visuelle Reize auf die Photorezeptoren in der Scheibe, um Licht hervorgerufene aktuelle Antworten zu entlocken. Während der Aufnahmen haben wir versorgen die Scheibe mit pharmakologischen Mitteln, wobei eine 8-Kanal-Perfusion-System ermöglicht es uns, schnell zwischen verschiedenen Agenten zu wechseln. Die Netzhaut Scheibe Vorbereitung ist weithin bekannt für Patch Clamp Messungen in der Netzhaut, insbesondere auf amakrinen oder bipolare Zellen, die nicht zugänglich sind in einer ganzen-mount Vorbereitung zu studieren.
Protocol
Discussion
Vorteile:
- Alle Zelltypen sind zugänglich
- Leichte Identifikation von Zelltypen, insbesondere wenn ein Fluoreszenzfarbstoff an die Elektrode zugesetzt
- Pharmakologische Wirkstoffe leicht zu erreichen Zielzellen
- Die Patch-Clamp-Technik erlaubt es, die Rolle der verschiedenen Ionenkanäle in der Netzhaut Berechnungen zu untersuchen. Die gleichen Informationen können nicht durch extrazellulären spike-Aufnahmen oder Aufnahmen mit scharfen Elektroden erzielt werden.
- Die…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instruments | ||
| Lucivid | Microscope image injector | Mbf bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannfin corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | Milipore | HAWPO1300 | .45µm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan (Nashville, TN) |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
