Este vídeo muestra el proceso de células enteras grabaciones pinza de voltaje en la porción de retina de la salamandra tigre acuático. Se demuestra la preparación de la corte, así como la forma de realizar grabaciones de patch clamp durante la estimulación visual de la retina.
Abstract
Utilizamos la técnica de patch clamp de célula entera para estudiar los circuitos sinápticos que subyace en el procesamiento de información visual en la retina. En este vídeo, le guía a través del proceso de desarrollo de células enteras grabaciones de la luz corrientes evocadas de células individuales en la preparación rebanada de la retina. Usamos el medio ambiente acuático salamandra tigre como un modelo animal. Comenzamos con la descripción de la disección de los ojos y mostrar cómo se montan las rebanadas de registros electrofisiológicos. Una vez que el corte se coloca en la cámara de grabación, que muestran cómo realizar grabaciones de células enteras de fijación de voltaje. A continuación, los proyectos de estímulos visuales en los fotorreceptores en el corte de luz para obtener respuestas evocadas actual. Durante la grabación que perfundir en el sector con agentes farmacológicos, por un sistema de perfusión de 8 canales que nos permite cambiar rápidamente entre los diferentes agentes. La preparación rebanada de retina es ampliamente utilizado para las grabaciones de patch clamp en la retina, en particular para estudiar amacrinas o células bipolares, que no son accesibles en una preparación de todo el montaje.
Protocol
Soluciones Solución intracelular de las células ganglionares (en mM): 100 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM sulforodamina B (para la tinción), ajustada a pH = 7,4 con KOH Solución intracelular de las células bipolares (en mm): 90 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM sulforodamina B (para la tinción), ajustada a pH = 7,4 con KOH Ringer extracelular de solución (en mM): 112 NaCl, 5 de glucosa,…
Discussion
Beneficios:
Todos los tipos de células son accesibles
Fácil identificación de los tipos de células, en particular si un tinte fluorescente se añade a la solución de electrodos
Agentes farmacológicos pueden llegar fácilmente a las células diana
La técnica de patch clamp permite investigar el papel de los diferentes canales iónicos en los cálculos de la retina. La misma información no se puede obtener a través de grabaciones extracelulares pico o grabaciones con electr…
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Multiclamp 700A
Patch Clamp Amplifier
Molecular Devices
SZX9
Dissection Micropscope
Olympus
BX50WI
Upright Microscope
Olympus
Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp
Werner, B., Cook, P. B., Passaglia, C. L. Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice. J. Vis. Exp. (17), e771, doi:10.3791/771 (2008).