Denna video visar processen helcells-inspelningar spänning klämma i retinal bit av vattenlevande tiger salamandern. Vi visar förberedelserna för den del, liksom hur man utför inspelningar patch clamp under visuell stimulering av näthinnan.
Abstract
Vi använder helcells-tekniken patch clamp att studera de synaptiska kretsar som ligger bakom visuell information bearbetning i näthinnan. I den här videon kommer vi att guida dig genom processen att utföra helcells-inspelningar av ljuset framkallade strömmar av enskilda celler i näthinnan skiva beredning. Vi använder vattenlevande tiger salamandern som en djurmodell. Vi börjar med att beskriva dissekering av ögat och visa hur skivor är monterade för elektrofysiologiska inspelningar. När skiva är placerad i inspelningen kammare, visar vi hur du utför helcells-inspelningar spänning klämma. Vi projicerar då visuella stimuli på fotoreceptorer i segmentet att framkalla ljus framkallat Dagens svar. Under inspelningen vi BEGJUTA segmentet med farmakologiska medel, där en 8-kanals perfusion systemet tillåter oss att snabbt växla mellan olika aktörer. Näthinnans skiva preparatet används ofta för inspelningar patch clamp i näthinnan, i synnerhet för att studera amakrina eller bipolär celler, som inte är tillgängliga i hela montera beredning.
Protocol
Lösningar Intracellulär lösning för ganglion celler (i mm): 100 K-glukonat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, 0,5 GTP, 90 mikroM Sulforhodamine B (för färgning), justerat till pH = 7,4 med KOH Intracellulär lösning för bipolär celler (i mm): 90 K-glukonat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, 0,5 GTP, 90 mikroM Sulforhodamine B (för färgning), justerat till pH = 7,4 med KOH Extracellulär Ringers lösning (i mm): 112 NaCl, 5 glukos, 5 HEPES,…
Discussion
Fördelar:
Alla celltyper är tillgängliga
Enkel identifiering av celltyper, särskilt om en fluorescerande färg läggs till elektroden lösningen
Farmakologiska agenter kan lätt nå målceller
Plåstret clamp tekniken tillåter att undersöka betydelsen av olika jonkanaler i retina beräkningar. Samma information kan inte erhållas genom extracellulära spik inspelningar eller inspelningar med skarpa elektroder.
Denna teknik kan tillämpas på andra djurmodelle…
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Multiclamp 700A
Patch Clamp Amplifier
Molecular Devices
SZX9
Dissection Micropscope
Olympus
BX50WI
Upright Microscope
Olympus
Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp
Werner, B., Cook, P. B., Passaglia, C. L. Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice. J. Vis. Exp. (17), e771, doi:10.3791/771 (2008).