Generering av benmärg härledda Murine dendritiska celler för användning i 2-fotonen Imaging
Summary
Antigen presentation i sekundära lymfoida organ av dendritiska celler är avgörande för inledandet av T-cells medierade adaptiva immunsvaret. Här kan vi visa på kulturen i benmärgen härrör murina dendritiska celler, aktivering och märkning för 2-photon avbildning.
Abstract
Flera metoder för beredning av murina dendritiska celler kan hittas i litteraturen. Här presenterar vi en metod som ger mer än 85% CD11c stora dendritiska celler i kultur som hem till dränerande lymfkörteln efter subkutan injektion och presentera antigen för att antigen specifika T-celler (se video). Dessutom använder vi Essen Instruments Incucyte att spåra dendritiska celler mognad, där, på dag 10, är morfologi av de odlade cellerna typiska för en mogen dendritiska celler och <85% av celler CD11chigh. Studien av antigen presentation i perifera lymfkörtlar med 2-fotonen imaging visade att det finns tre distinkta faser av dendritiska celler och T-cell interaktion 1, 2. Fas I består av korta seriella kontakter mellan mycket rörliga antigen specifika T-celler och antigen bär dendritiska celler 1, 2. Fas två präglas av långvarig kontakt mellan antigen-specifika T-cell och antigen bärande dendritiska celler 1, 2. Slutligen är fas III kännetecknas av T-celler lossnar från dendritiska celler, återfå rörlighet och börjar dela 1, 2. Detta är ett exempel på den typ av antigen-specifika interaktioner som kan analyseras med två-photon avbildning av antigen-laddad cell tracker dye-märkta dendritiska celler.
Protocol
Discussion
Dendritiska celler är viktiga förmedlare av det adaptiva immunsvaret och den mest effektiva antigenpresenterande celler kännetecknas hittills. Metoder för människa och mus dendritiska cellodling i litteraturen skiljer sig i den typ av cytokiner som används för att påverka utvecklingen av olika dendritiska celltyper. Anmärkningsvärt är att GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alfa och IFN-gamma används i olika kombinationer för att producera mogna, omogna, inflammatoriska och steady-state som murin benmärg härrör dendritiska celler …
Acknowledgements
National Institutes of Health Kirchstein Fellowship predoctoral gemenskap AI-64.128 (MPM), GM-41.514 (MDC), GM-48.071 (IP)
References
- Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J Exp Med. 200, 847-856 (2004).
- Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).
- Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102, 1753-1763 (2003).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF. J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. 3, (2001).
- Winzler, C., et al. Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures. J Exp Med. 185, 317-328 (1997).
- Koch, F., et al. Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation. J Exp Med. 171, 159-171 (1990).
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Wei, S. H., et al. Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node. J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).
- Castellino, F., et al. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).
