ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

Summary

ESCの分化は、細胞型特異的構造の変化とクロマチンの構成と一致している。これらの変更の検出はstemcellnessと細胞分化を定義するメカニズムが貴重な洞察を提供します。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、幹細胞の分化の分子メカニズムを解明する貴重な方法を表します。

Abstract

後生動物の生物の細胞の無数の機能と構造の複雑さは、幹細胞の数が少ないから生じる。自己再生および多能ほぼすべての細胞の¹型に分化する幹細胞を可能にする：幹細胞は、2つの基本的な性質によって特徴付けられる。分化した細胞への進行の幹細胞は、活動の確立と細胞型特異的遺伝子発現パターンを維持するため、多能な構造と形態変化と転写因子の階層的活性とシグナル伝達分子、の損失によって特徴付けられる。分子レベルで、細胞の分化は、幹細胞と細胞の分化過程^2,3の機能的特徴に貴重な洞察を提供することができるダイナミックなクロマチンの構造や組成の変化とそれらの動的変化の検出を行います。クロマチンは、タンパク質、主にヒストン⁴セルパッケージ染色体DNAを形成する高度に圧縮されたDNA -タンパク質複合体です。 Stemcellnessと細胞分化は、このようなエピジェネティックな因子、ヒストン変異体、および転写因子^2,3,5のような調節タンパク質の特定の配列の存在と相関している。

クロマチン免疫沈降（ChIP）は、RNAの存在、タンパク質、およびクロマチン^6,7におけるタンパク質修飾を監視するための貴重な方法を提供する。異なる種類の細胞からクロマチンの比較では、細胞分化時に発生するタンパク質-クロマチン団体のダイナミックな変化を解明することができます。

クロマチン免疫沈降法はin vivoで架橋クロマチンでの精製を含む。分離されたクロマチンは、酵素消化または機械的な力によってより小さな断片に還元される。クロマチンの断片は、タンパク質またはタンパク質とDNAの変化を標的とする特異的抗体を用いて沈殿させる。沈殿したDNAまたはRNAを精製し、PCRやDNAマイクロアレイを用いたアッセイのためのテンプレートとして使用されます。成功したChIPの前提条件は、所望の抗原と標的分子を発現していないコントロール細胞からクロマチンの可用性への高品質な抗体です。 CHIPは蛋白質、蛋白質とRNAの変更、および特定の標的DNAとRNAの存在を相互に関連付け、そして、outreadツールの選択に応じて特定の標的遺伝子で、またはゲノム全体の文脈における標的分子の結合を検出することができます。分化細胞のクロマチン中のタンパク質の分布の比較では、細胞系列に沿って細胞の進行に合わせクロマチン構成の動的変化を解明することができます。

Protocol

解凍ES細胞（ビデオで紹介していない） ES細胞は、10％DMSOを含む培地中で凍結されています。 DMSOは、ES細胞の分化を誘導することができるので、遅い時刻に細胞を解凍し、その残留DMSOの影響を最小限に抑えるために、次の朝、培地を変更することができます。 コー​​トは少​​なくとも15分間、0.1％ゼラチンで6ウェル組織培養プレートとのプレートの細胞に前にすぐにオフ吸引。 37℃の水浴で融解ES細胞（約5 × 1コンフルエントに相当する10 6細胞、6穴）と温めておいたES細胞用培地10mlに希釈する。 ベンチトップ臨床遠心分離機で1000rpmで10分間回転させて細胞をペレット化。 37℃温めた培地10 mlに培地と穏やかに懸濁し、細胞をオフに吸引除去する。 6ウェルプレートへの転送細胞懸濁液と37℃で加湿5％CO 2インキュベーターでC。 死んだ細胞や残留DMSOを除去するには、次の日培養液を交換する。 ES細胞培養物の通過と拡大 ES細胞は、日常的に3分の2日毎に継代している、とメディアが別の日に変更されます。従って、ES細胞は、毎日の注意が必要です。我々の経験では、フィーダに依存しないES細胞は急速に成長し、すぐにそれは黄色の回転、培地を酸性化。細胞は（毎日メディアを変更しないか、または低すぎる希釈で細胞を継代することによって）培地を酸性化できるようにすることは、それらの分化全能性を保障できない後、過剰な分化と細胞死を誘発する、細胞が危機を受けることになります。細胞がコンフルエントに達する前に、大きな塊を形成し、これらの塊内の細胞が分化したり、死んでしまうとあまりにも低密度、継代時の細胞の不十分な分散、または不均一なメッキでメッキの細胞は、同様の問題が発生する可能性があります。彼らは注射の時に健康に見える場合でも、生殖細胞の伝達が大幅に、虐待されている細胞では減少している。 細胞のコンフルエント6ウェルプレート用培地をオフに吸引し、細胞から離れてピペッティング、37℃温めたPBSの2-3 mlの洗浄。 1の1ミリリットル×細胞が一様に小さな塊に分散されるまで3〜4分またはトリプシン溶液で細胞をカバー。 トリプシンを不活性化する培地1mlを追加。 たてゼラチン6ウェルプレートにトリプシン処理細胞とプレートの細胞を（通常は井戸の2 / 5）収集。 凍結ES細胞上記のようにコンフルエント6ウェルプレート（約1 × 10 7細胞）をトリプシン処理。 1,000 rpmで5分間、培地とペレットの9 mlのトリプシン処理細胞を集める。 メディアと作りたての凍結培地1mlに再懸濁し、細胞ペレットをオフに吸引除去する。 twoクリオチューブに分注し、細胞の0.5mlを。 -80バイアルを凍結℃で一晩と長期保存用液体窒素への転送。 チップオンチップPROCEDURE 免疫沈降ホルムアルデヒドの架橋の細胞（浮遊細胞用） 各免疫沈降のための1 × 10 8細胞- 5 × 10 7を使用してください。 1％の濃度で細胞懸濁液に、新鮮なホルムアルデヒドを追加。 室温で10分間、ホルムアルデヒド溶液で細胞をIncubates。 ホルムアルデヒドをクエンチするために1.25 Mグリシンの1 / 10量を追加。 1 × PBS 10mlで細胞を2回すすいでください。 プールの50 mlコニカルチューブに細胞と4℃で5分間700グラムでスピン℃のLysis Bufferを1.5 mlの上清とペレットを再懸濁しますを捨てる。 1.5mlマイクロチューブに細胞を移す。 液体窒素で3回の細胞を急速冷凍し、細胞を破壊する組織グラインダーを使用してください。一度細胞が架橋され、​​それらは-80℃、無期限で凍結保存することができる。 （ステップはすべて4℃で行われる）、磁気ビーズを準備する 1.5ミリリットル低い保持マイクロチューブにDYNALビーズ50μlを追加します。免疫沈降あたりのビーズの1管を設定します。 1 mlのブロックのソリューションを追加。 DYNAL MPCを使用してビーズを収集する。磁気ラックにチューブを置きます。ビーズがチューブの側面に収集することができます。これは、約15秒間を取る必要がありますビーズを収集するために二回ラックを反転。ピペッターで上清を取り除く。 まだ場所のチューブで、ラックと反転ラックから磁気ストリップを除去する際に1 mlのブロックのソリューションと静かに再懸濁しますビーズを追加 – ビーズを均等に再懸濁している10〜20倍のどちらか、またはまで。 （ステップ2）上記のようにビーズを収集する。ピペッターで上清を取り除く。 ステップ3、複数の時間のように、1.5 mlのブロックソリューションでビーズを洗浄する。 750μlのブロックソリューションでビーズを再懸濁し、抗体10μgを追加します。ローテーター上、または一晩、6時間の最小値に対して4℃でインキュベートする。 ビーズを3 tを洗う1 mlのブロックソリューションでIMEを、​​手順3で説明した。 細胞の超音波処理 -80〜凍結した細胞ペレットを取り外し° Cと超音波処理のためのチューブへの転送細胞を。我々は現在、超音波処理のための標準polupropyleneの一番下、15mlコニカルチューブを使用することを好む。我々は、5 mlのマークで、2枚でチューブをカットし、上半分を捨てる。設定中にチューブをパラフィルムでまたはチューブのキャップとカバーすることができます。 音波処理器のプローブは約0.5〜1.0センチメートルチューブの底の上に座っているので、マイクロチューブのラック、位置のチューブを使用。プローブが中央揃えされているとチューブの側面に接触しないように注意してください。 （プローブのポジショニングは、超音波処理中に、ソリューションのフォームかどうか影響を与える可能性があります。一般に、発泡は、超音波処理したDNAが不完全にせん断されることを示します。） 20秒の間にサスペンション6回超音波処理サンプルは超音波処理中に氷水浴中で維持する必要があります。発泡小さくするには、最初に0に出力電力を設定し、最初のバーストの間に最終的な電源を手動で増やす。 （発泡著しいがある場合は、すべての気泡がない泡泡を残さず、すべての材料の穏やかな再懸濁が続く2万グラムの遠心分離により除去することができます。） 4℃で10分、20,000 gでスピン° Cペレットの破片や1.5 mlチューブの収穫上清へ。 入力のDNAとして、各サンプルからの細胞溶解液の50μlを保存します。 -20℃で保存少なくとも一つの入力のDNAのアリコートを超音波処理ライセートのバッチごとに維持する必要があります。超音波処理とフラグメントサイズの結果の分布の影響の影響のみ架橋反転およびDNAの精製後にチェックすることができることに注意してください。 クロマチン免疫沈降 セル超音波処理から1 × 10 8細胞を 1 mlの最終容量（これは可能で、磁気ビーズ 、ステップ6の準備から50μlの抗体/磁気ビーズミックスへステップ4 – 5 × 10 7のクロマチン相当額を追加もしあったとしても、溶解緩衝液で調整することが可能）。 4℃でローテーター上で一晩インキュベート℃の洗う DYNAL MPCを使用してビーズを収集する。ラックにチューブを置きます。ビーズがチューブの側面に収集することができます。これは、約20秒を取る必要がありますすべてのビーズを集めるために二回ラックを反転。サンプル間のヒントを変更する、ピペッターで上清を取り除きます。 1mlの溶解各チューブにバッファーと優しく再懸濁しますビーズを追加。 10〜20倍やビーズが均等に再懸濁するまで – これは、まだ場所のチューブで、ラックと反転ラックから磁気ストリップを除去することによって行うことができます。ビーズを集める。ピペッターで上清を取り除きます。洗浄の間にヒントを変更する、この洗浄を5回繰り返します。 手順2で説明1ミリリットルIP1バッファーでビーズを6回洗浄する。 手順2で説明、1mlのIP2のバッファーでビーズを6回洗浄する。 手順2で説明1ミリリットルTE 8.0バッファーでビーズを6回洗浄する。 4℃で3分間℃、残存するTEバッファーを除去するための960グラムでスピン。 溶出 15分間65 ° Cのウォーターバスでチューブをインキュベートすることにより、ビーズから溶出緩衝液と溶出物質210μlを添加する。ボルテックスは、簡単にすべての2分。このインキュベーションは、溶出液の回収を向上させることができます30分、限り、拡張することができます。 室温で1分間に16,000 gでビーズをスピンダウン。 上清の200μlを取り出し、新しいチューブに移す。材料は、-20℃で凍結し、一晩保存することができます。 架橋逆転 6時間と15時間（架橋逆転の時間が長いほど、通常はマイクロアレイ解析でノイズが増加につながる）の最大値の最小値を65℃でインキュベートすることにより、 溶出 、ステップ3から免疫沈降したDNAを架橋逆。チューブが均一に加熱して形成された以下の結露があるとされるように、このインキュベーションは、オーブンで行うことができます。 超音波処理した後、予約入力のDNA（ステップ13）の50μlを解凍、溶出バッファーと混合150μlの（3巻）に追加します。 ° C 架橋反転 、ステップ1のように65℃でインキュベートすることにより、この入力のDNAを架橋逆。この点から、免疫沈降または入力のDNAのすべてのチューブは、以降のステップを処理するための別のチューブまたはサンプルであると考えられる。 精製DNA 10mgのML – 1 RNaseA（0.2mgのML – 1最終濃度）の8μlの、転倒混和数回混和すると2時間、37℃でインキュベートする 55チューブを数回とインキュベートすることにより20mgのML – 1プロテイナーゼK（0.2μgのML – 1最終濃度）とミックスの4μlを加え、℃で2時間インキュベートする。 クロロホルム：イソアミルアルコール（P：C：IA）、渦、2mlのヘビーフェーズロックチューブ（エッペンドルフで提供される指示に従って）を持つ別の相400μlのフェノールを追加。 Pの場合：C：IAソリューションが古い場合や低いpHでいる、degrが存在します有効なターゲットの検出のマイクロアレイ解析と損失でノイズの原因となるDNAのadation、。 5M塩化ナトリウム（200mMの）最終濃度）および20μμL- 1グリコーゲン（30μgの合計）1.5μlを16μlを含む新しい遠心チューブに水層を移す。 800μlのEtOHを追加します。 -20℃または-80℃で30分で一晩インキュベートします。 4時10分、20,000 gでスピン° CをペレットDNAに。 、80％エタノール500μlを添加しペレットを再懸濁しますにボルテックスし、4℃で5分間、20,000 gで再びスピン℃でペレットを洗浄してください残りの80％EtOHを取り外します。残りの液体を回収し、ペレットを避け、pipettemanと液体削除するには、チューブを軽くスピン。ペレットだけで乾燥しているまで、チューブの空気が乾燥してみましょう：ペレットはまだ湿って外観を保持する必要があります。 10mMトリス- HCl、pH8.0を70μlの各ペレットを再懸濁します。 これらのペレットのOverdryingとそれらを再懸濁させることが困難、または離れてチューブの側面からのフレークと皮に責任を負うことができます。 オプション：将来の使用のために免疫沈降サンプル15μlを保存。この材料は、マイクロアレイの結果の遺伝子特異的PCRの確認を実行するために使用できます。 UV吸収（260 nm）のことで濃度を定量化する。 NB：ライブラリの準備および増幅を含めて、次の手順のdNTPなしシグマから10Xアンプミックスで修正されたGenomePlexのWGAキットを使用する： ライブラリの準備シグマから10XアンプミックスとGenomePlexのWGAキットで入手可能 精製DNAを 、PCRチューブにステップ11からDNAサンプル10μlの1 ×ライブラリの準備の緩衝液2μlを添加する。 ライブラリの安定化溶液1μlを追加。 徹底的にボルテックスでは、95℃遠心分離し、サーマルサイクラー内の場所によって統合℃で2分間。 サンプルを氷上で冷却、遠心分離で遠心して統合し、氷に戻ります。 、ライブラリの準備の酵素の1μlを加え、徹底的にボルテックスし、スピンダウンする。 次のようにサーマルサイクラーとインキュベートの場所のサンプル： 20分間16 ° C 20分間24 ° C 20分間37 ° C 5分間75 ° C 4℃保持サーマルサイクラーと遠心短時間からサンプルを削除します。サンプルは20℃で3日間、すぐに増幅または保存することができる。 増幅シグマから10XアンプミックスとGenomePlexのWGAキットで入手可能マスターミックスは、以下、ステップ3〜15μlの反応液に以下の試薬を加えることにより調製される。 10Xアンプミックス7.5μlの（dNTPsを除く） WGA DNAポリメラーゼ5.0μlをの10mMのdNTP（各）株式（終濃度0.4mMの）3.0μL ヌクレアーゼフリー水で75μlに最終反応容量をもたらす徹底的にボルテックス。短時間遠心し、熱サイクルを開始します。 3分間の初期変性95 ° C 次のように14サイクルを実行します。 変性94℃15秒のためのC 65をアニール/伸長℃で5分間サイクリングが完了したら、4で反応を維持する分析または精製の準備ができるまで℃または-20℃で保存。 製造元の指示に従ってQuiagenからPCR精製とDNA ®キットを浄化し、UV吸収（260 nm）のことで濃度を定量化する。 以下の適応で、 ライブラリの準備 、 増幅を介して手順1、手順2から再度増幅のサイクルを実行します。 •断片化のプロセスを開始するために、上記、手順3から必要なDNA量に関する：、DNAの濃度は、約200から300μg/ mlのであれば、サンプル2.5μlを使用し、10μlの最終容量のために水で調整。 DNAの濃度50〜60μg/ mlの周りの場合は、サンプルの5μlを使用し、10μlの最終容量のために水で調整します。 •この第2の増幅工程では、マスターミックスdTTPsとのdNTPが10 mMのdATPを、10mMのdGTPを、10mMのdCTPおよび8mmのdTTPのと同じ濃度その前のミックスで、2 mMのdUTPを含むミックスのための交換です。 紫外可視分光光度計（260nmの）を使用してDNAを測定します。通常は、増幅されたDNAのより大きいより9μgの各反応から得られる。 NB：DNAターゲットのラベリングが搭載されたGeneChipで実行される® Affymetrix社からWT二本鎖DNAのターミナルのラベリングキットを製造業者の指示に従って、下記のように： 断片増幅のターゲットフラグメントターゲットを入力するかを配列に応じて以下の適切なテーブルを使用してサンプルがハイブリッドになるに化された。 表1。単一のアレイ用のフラグメンテーションミックス 1 RXNのコンポーネントボリューム/金額 二本鎖DNA 7.5μgの 10XのcDNA断片化4.8μL UDG、10 U /μlを1.5μL APE 1、100 U /μL2.25μL 最大48μlにヌクレアーゼフリー水アフィメトリクスから搭載されたGeneChip ® WT二本鎖DNAのターミナルラベリングキットで利用可能 表2。マルチアレイセットのフラグメンテーションミックス 1 RXNのコンポーネントボリューム/金額 二本鎖DNA 9μgの 10XのcDNA断片化4.8μL UDG、10 U /μlを1.5μL APE 1、100 U /μL2.25μL 最大48ヌクレアーゼフリー水アフィメトリクスから搭載されたGeneChip ® WT二本鎖DNAのターミナルラベリングキットで利用可能上記のいずれかのテーブルに応じて断片化のミックスを設定します。フリックミックスとチューブをスピンダウン。 で反応をインキュベートする。 1時間37℃ 2分間93℃。 少なくとも2分間、4℃。 フリックミックス、チューブをスピンダウンし、新しいチューブにサンプルの45μlを移す。 ゲルシフト分析のために各サンプル2μlを削除します。 ラベル断片化された二本鎖DNA 下の表のように、二本鎖DNAのラベリングミックスの調製： 表3。二本鎖DNAのラベリングミックスの構成 1 RXNのコンポーネントボリューム/金額 5X TDTバッファー12μlの TDT2μlの DNAのラベリング試薬、5mMの1μL トータルボリューム15μlのアフィメトリクスから搭載されたGeneChip ® WT二本鎖DNAのターミナルラベリングキットで利用可能フリックミックス、DNAサンプルに二本鎖DNAのラベリングミックス15μlを加え、そしてそれらをスピンダウン。 で反応をインキュベートする。 37 ° Cで60分間。 10分間70 ° C。 4℃で少なくとも2分間。 ゲルシフト分析のために各サンプル2μlを削除します。 ゲルシフト分析 4％アガロースゲルを準備します。 フラグメントの増幅のターゲット 、ステップ5とラベル断片化された二本鎖DNA、65℃ステップ4℃で2分間からサ ​​ンプルをインキュベートする。 ストレプトアビジン（1 mg / ml）を10μl加え、そして室温で5分間サンプルをインキュベートする。 ラベリング製品のシフト移行を確認するには、4％アガロースゲル（ ゲルシフトの解析 、ステップ1）にステップ3からサ ​​ンプルを実行します。 アレイハイブリダイゼーションとアレイの洗浄カリフォルニア大学リバーサイド校のゲノムセンターで行って。 配列の解析コンピューター解析によって実行されます。 バッファー成分： ブロックソリューション：PBS + 0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）。 溶解バッファー：50mMのHEPES – KOH、pH7.5の 140mMのNaCl 1mMのEDTA 1％トリトンX – 100 0.1％SDS 1mMのPMSF 最終的にpH7.5の IP1：溶解バッファー+500 mM NaClを IP2：10mMトリス- HCl 250mMの塩化リチウム 1mMのEDTA 0.5％NP – 40 0.5％ナトリウムDioxycholat 最終的にpH8.0の TE：10mMトリス、pH7.4の 1mMのEDTA 最終的にpH8.0の溶出バッファー：TE緩衝液+ 1％SDS。

Discussion

クロマチン免疫沈降（ChIP）は、細胞の分化に伴うクロマチンベースのプロセスの解剖のための貴重な技術を提供しています。この方法の成功のための前提条件は、良好な抗体と目的の抗原を欠いているコントロールの細胞または組織からクロマチンの可用性です。 DNAマイクロアレイ技術のチップを組み合わせることで、膨大な量の情報が得られる。 ChIPの結果の検証は、セルの開発中に生物学的プロセスの実行で、タンパク質修飾および/またはRNAをタンパク質の動的な関連付けをリンクさせることができる適切なテストシステムの可用性に依存します。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Poteinase-K	Reagent	Roche	#EO0491
RNase-A	Reagent	Fermentas	#EN0531
formaldehyde 37%	Reagent	EMD	FX040-13
Chloroform	Reagent	EMD	3150
Ethanol	Reagent	Goldshield
phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Reagent	Invitrogen	15593-031
SA, fraction V	Reagent	EMD	2930
Dubecco’s Phosphate Buffered Saline	Reagent	Gibco	14190
HEPES	Reagent	EMD	5330
Sodium Chloride	Reagent	Fisher Scientific	S271-10
EDTA	Reagent	EMD	4050
Triton X-100	Reagent	EMD	9410
Sodium Dodecyl Sulfate	Reagent	J.T Baker	4095-02
Lithium chloride	Reagent	EMD	5910
Tris-HCl	Reagent	EMD	9230
NP-40	Reagent	Calbiochem	492015
Deoxycholic acid, sodium salt	Reagent	Fisher Scientific	BP349-100
Ammonium acetate	Reagent	Applichem	631-61-8
Glycine	Reagent	EMD	4840
Glycine	Reagent	EMD	4840
dynalbeads, protein A	Reagent	Invitrogen	100.02D
dynalbeads, protein G	Reagent	Invitrogen	100.04D
1.5ml Low Retention Microtubes, Xtreme	Other	Phenix Research Products	MAX-815S
Phase Lock Gel Light, 2.0 ml	Reagent	Eppendorf	955154037