Хроматин Иммунопреципитация из человеческих эмбриональных стволовых клеток

Summary

Дифференциация ESC совпадает с камерного типа специфические изменения в структуре и составе хроматина. Обнаружение этих изменений дает ценную информацию о механизмах, которые определяют stemcellness и дифференцировки клеток. Хроматин иммунопреципитации (чип) представляет собой ценный метод препарировать молекулярные механизмы, лежащие дифференциации стволовых клеток.

Abstract

Функциональную и структурную сложность несметное число клеток в многоклеточных организмах возникает небольшое количество стволовых клеток. Стволовые клетки характеризуются двумя основными свойствами: самообновлению и multipotency, который позволяет стволовых клеток дифференцироваться в практически любой тип клеток ^1. Клеточного стволовых дифференцированных клеток характеризуется потерей multipotency, структурные и морфологические изменения и иерархической активности транскрипционных факторов и сигнальных молекул, чья деятельность устанавливать и поддерживать камерного типа определенных закономерностей экспрессии генов. На молекулярном уровне, клеточной дифференцировки включает динамические изменения структуры и состава хроматина и выявление тех, динамические изменения могут предоставить ценную информацию о функциональных особенностях стволовых клеток и процесса дифференцировки клеток ^2,3. Хроматин спрессованный ДНК-белкового комплекса, который образуется при клетками пакет хромосомной ДНК с белками, в основном, гистоны ^4. Stemcellness и дифференцировки клеток коррелирует с наличием специфических массивов регуляторных белков, таких как эпигенетические факторы, гистоновых вариантов, и транскрипционных факторов ^2,3,5.

Хроматин иммунопреципитации (чип) дает ценный метод для мониторинга присутствия РНК, белков и белковых модификаций хроматина ^6,7. Сравнение хроматина из разных типов клеток может выяснить динамические изменения в белок-хроматина ассоциаций, которые происходят во время дифференцировки клеток.

Хроматин иммунопреципитации включает в себя очистку в естественных условиях сшитого хроматина. Изолированных хроматина сводится к более мелкие фрагменты от ферментативного пищеварения или механической силы. Хроматин фрагменты выделяются с использованием специфических антител к целевой белки или белков и ДНК модификаций. Осажденного ДНК или РНК, очищается и используется в качестве шаблона для ПЦР или ДНК-микрочипов основан анализов. Предпосылки для успешного ChIP высокие антитела качества желаемого антигена и доступности хроматина из-под контроля клеток, которые не выражают молекулой-мишенью. Чип может коррелировать присутствии белков, белков и РНК модификаций, а РНК с конкретной ДНК-мишени, и в зависимости от выбора outread инструмент, обнаруживает связь молекул-мишеней в определенных генов-мишеней, или в контексте всего генома. Сравнение распределения белков в хроматина дифференциации клетки могут выяснить динамические изменения хроматина состава, которые совпадают с прогрессией ячеек по клеточной линии.

Protocol

Размораживание ЭС клетки (не получившие отражения в видео) ЭС клетки замораживаются в среде, содержащей 10% ДМСО. С ДМСО может индуцировать дифференцировку ЭС клеток, это может быть возможным, чтобы растопить клетки в конце дня и таким образом изменить среду утром следующего дня, чтобы минимизировать эффект остаточного ДМСО. Пальто 6-и культуре ткани пластины с 0,1% желатина в течение 15 мин и аспирации немедленно, прежде чем пластина ячеек. Оттепель ЭС клетки (примерно 5 × 10 6 клеток, эквивалентные одному сливной 6-а) в 37 ° С водяной бане и разводят в 10 мл нагретого среда ячейки ES. Гранул клетки, крутя в течение 10 минут при 1000 оборотов в минуту в настольный клинической центрифуге. Аспирируйте от среднего и мягко ресуспендирования клеток в 10 мл 37 ° C нагретого среды. Передача клеточной суспензии для 6-луночного планшета и расти при 37 ° С в увлажненной 5% СО 2 инкубатора. Изменение среды на следующий день, чтобы удалить отмершие клетки и остаточных ДМСО. Прохождение и расширение культуры ЭСК ЭС клетки обычно пассируют каждые 2 / 3 дня, и среда изменяется в разные дни. Таким образом, ЭС клетки требуют ежедневного внимания. По нашему опыту, фидерных независимой ЭС клетки быстро растут и быстро подкисляют среду, превращая его желтым цветом. Разрешение клетки для подкисления среды (не изменяя СМИ каждый день или по пассирования клетки на слишком низком разведении) вызовет клеток к кризису, вызывая превышение дифференцировки и гибели клеток, после чего их тотипотентность не может быть гарантирована. Покрытие клетки при слишком низкой плотности, недостаточной дисперсией клеток во время прохода, или неровных покрытий может вызвать подобные проблемы, а клетки образуют крупные скопления, не достигнув слияния и клеток внутри этих сгустков будет дифференцироваться или умереть. Зародышевой линии передачи значительно снижается в клетках, которые были плохо обращались, даже если они кажутся здоровыми во время инъекции. Для сливной 6-луночный планшет клеток аспирата среды от и промыть 2-3 мл 37 ° C нагретого PBS, пипетки его подальше от клетки. Обложка клеток с 1 мл 1 × раствора трипсина в течение 3-4 минут или до клетки равномерно распределены на мелкие сгустки. Добавьте 1 мл среды для инактивации трипсина. Сбор трипсином клетки и клетки пластины (как правило, 2 / 5 от а) до свежей желатинизированный 6-луночный планшет. Замораживание ЭС клетки Trypsinize сливной 6-луночного планшета (примерно 1 × 10 7 клеток), как описано выше. Сбор трипсином клетки в 9 мл среды и гранул в течение 5 минут при 1000 оборотах в минуту. Аспирируйте от средних и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл свежеприготовленного замерзания среды. Алиготе 0,5 мл клетки на две cryotubes. Замораживание флаконах при температуре -80 ° С в течение ночи и трансфер в жидком азоте в течение длительного хранения. ChIP-на-чипе ПОРЯДОК Иммунопреципитация Формальдегид сшивания клетки (для приготовления суспензии клеток) Используйте 5 х 10 7 – 1 х 10 8 клеток для каждого иммунопреципитации. Добавьте свежие Формальдегид к суспензии клеток в концентрации 1%. Насиживает клетки раствор формальдегида в течение 10 минут при комнатной температуре. Добавить 1 / 10 объема в 1,25 М глицин, чтобы утолить формальдегида. Промойте клетки в два раза по 10 мл 1x PBS. Бассейн клеток в 50 мл конические пробирки и вращаются на 700 г в течение 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 1,5 мл лизирующего буфера. Передача клеток в 1,5 трубки микроцентрифужную мл. Flash-заморозить три раза клеток в жидком азоте и использование тканей мясорубку сломать клетки. Как только клетки сшиты, они могут храниться замороженными при -80 ° C до бесконечности. Подготовка магнитных шариков (Шаги все проводили при 4 ° С) Добавить 50 мкл Dynal бисером до 1,5 мл низкой микропробирку хранения. Настройка 1 тюбик из бисера в иммунопреципитации. Добавить 1 мл Блок решение. Сбор бисером использованием Dynal ПДК. Место труб в магнитной стойке. Разрешить бисером собрать на стороне трубки. Это должно занять около 15 с Обратить стойку в два раза, чтобы помочь собрать бусы. Удалить супернатант с пипетки. Добавьте 1 мл раствора Блок и осторожно ресуспендируют бисером в удалении магнитной полосой от стойки и инвертирующего стойку, с трубами все еще на месте – или в 10-20 раз, или пока бусины равномерно ресуспендирования. Сбор бисером, как выше (шаг 2). Удалить супернатант с пипетки. Вымойте бусины 1,5 Решение Блок мл, как в шаге 3, еще один раз. Ресуспендируют бисером в 750 мкл раствора Блок и добавить 10 мкг антител. Инкубируйте при 4 ° С в течение минимум 6 часов, или на ночь, на ротатора. Вымойте бисером три тРедакторы IME в 1 Решение Блок мл, как описано в шаге 3. Сотовые ультразвуком Удалить замороженных гранул клетку от -80 ° C и передачи клеткам трубы для обработки ультразвуком. В настоящее время мы предпочитаем использовать нижнюю часть стандартного polupropylene, 15 мл коническую трубку для обработки ультразвуком. Режем трубки на две части по 5 мл марки и выбросить верхнюю половину. Трубы могут быть покрыты парафильмом или с трубкой крышки при настройке. Использование стойки микроцентрифужную трубку, позиция трубку так sonicator зонд находится примерно 0,5-1,0 см выше нижней части трубы. Позаботьтесь о том, датчик по центру и не контактирует стороны трубки. (Probe позиционирования может повлиять ли решение пены или не во время обработки ультразвуком. Как правило, пенящиеся указывает, что ультразвуком ДНК будет плохо стриженый.) Разрушать ультразвуком подвески 6 раз в течение 20 секунд Образцы следует хранить в ледяной бане в течение ультразвуком. Для уменьшения пенообразования, первоначально установлен выходной мощности до 0 и увеличения вручную, чтобы окончательный власть во время первого взрыва. (Если есть значительное вспенивание, все пузыри могут быть удалены путем центрифугирования при 20000 г следуют нежный ресуспендирования из любого материала, не оставив пену пузырей.) Спиновые в 20000 г в течение 10 мин при 4 ° С до гранул мусора и уборки супернатант в 1,5 мл трубки. Сохранить 50 мкл Клеточный лизат из каждого образца в качестве входных данных ДНК. Хранить при -20 ° C. По крайней мере, один вход ДНК аликвоты должны быть в партии разрушать ультразвуком лизат. Обратите внимание, что эффект воздействия ультразвуком и итогового распределения размеров фрагментов могут быть проверены только после сшивки разворота и очистки ДНК. Хроматин иммунопреципитации Добавить хроматин-эквивалентную сумму 5 х 10 7 – 1 х 10 8 клеток от клетки ультразвуком, шаг 4 до 50 мкл антител / магнитный шарик смесь из Подготовка магнитных шариков, Шаг 6 с конечного объема 1 мл (Это может быть можно регулировать с Лизис буфера, если когда-нибудь). Инкубируйте ночь на поворотное устройство при 4 ° C. Мыть Сбор бисером использованием Dynal ПДК. Место труб в стойке. Разрешить бисером собрать на стороне трубки. Это должно занять около 20 секунд Обратить стойку в два раза, чтобы помочь собрать все шарики. Удалить супернатант с пипетки, изменение советы между образцами. Добавить 1 мл лизирующего буфера в каждую пробирку и осторожно ресуспендируют бисером. Это может быть сделано путем удаления магнитной полосой от стойки и инвертирующего стойку, с трубками-прежнему на месте – в 10-20 раз, или пока бусины равномерно ресуспендировали. Сбор бисером. Удалить супернатант пипетки. Повторите это мыть еще 5 раз, меняя советы от стирок. Вымойте бисером 6 раз в 1 мл буфера IP1, как описано в шаге 2. Вымойте бисером 6 раз в 1 мл буфера IP2, как описано в шаге 2. Вымойте бисером 6 раз в 1 мл 8,0 TE буфера, как описано в шаге 2. Спиновые на 960 г в течение 3 мин при 4 ° С и удалить остатки буфера ТЕ. Элюирование Добавить 210 мкл буфера элюции и элюировать материал из бисера путем инкубации труб в 65 ° С на водяной бане 15 мин. Vortex кратко каждые 2 мин. Это инкубации может быть продлен до тех пор, как 30 минут, которые могут помочь улучшить восстановление элюата. Спином вниз бус на 16 000 г на 1 мин при комнатной температуре. Удалить 200 мкл надосадочной жидкости и перехода на новые трубы. Материал может быть заморожены при температуре -20 ° С и сохраняется в течение ночи. Crosslink разворота Обратный сшивания иммунопреципитации ДНК из Элюирование, Шаг 3 путем инкубации при температуре 65 ° С в течение минимум 6 ч и не более 15 ч (более длительное время разворота сшивания обычно приводит к увеличению шума в анализе микрочипов). Это инкубации может быть сделано в духовке так, чтобы трубка нагревается равномерно и там меньше конденсации образуется. Оттепель 50 мкл ДНК вход защищены после обработки ультразвуком (шаг 13), добавить 150 мкл (3 тома) буфера элюирования и перемешать. Обратный сшивания этот вход ДНК путем инкубации при температуре 65 ° С, как в Crosslink разворота, стадия 1. С этого момента каждый трубку иммунопреципитации или ввода ДНК считается отдельной трубе или образец для последующих этапов обработки. Очистка ДНК Добавить 8 мкл 10 мг мл-1 RNaseA (0,2 мг мл-1 конечная концентрация), перемешать путем обращения трубку несколько раз и инкубировать при 37 ° С в течение 2 ч. Добавьте 4 мкл 20 мг-1 мл протеиназы К (0,2 мкг мл-1 конечная концентрация) и перемешать путем обращения трубку несколько раз и инкубировать при 55 ° С в течение 2 ч. Добавить 400 мкл фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (P: C: IA), вихревые и отдельных фаз с 2 мл тяжелая труба Phaselock (следуйте инструкциям Эппендорф). Если P: C: И. А. Решение старых или при низких значениях рН, будет градadation ДНК, вызывая шум в микрочипов анализа и потеря обнаружения действительных целей. Передача водного слоя к новой трубки центрифуги содержащей 16 мкл 5М NaCl (200 мМ) конечная концентрация) и 1,5 мкл 20 мкл μ-1 гликогена (30 мкг общего количества). Добавить 800 мкл этанола. Инкубировать в течение ночи при температуре -20 ° С или 30 мин при температуре -80 ° C. Спиновые в 20000 г в течение 10 мин при 4 ° С для осаждения ДНК. Вымойте гранул путем добавления 500 мкл 80% этанола, вортексе для ресуспендирования гранул и спиннинг снова в 20000 г в течение 5 мин при 4 ° C. Удалите все оставшиеся 80% этанола. Спиновые труб кратко собирать любую оставшуюся жидкость и удалить жидкость с pipetteman, избегая гранул. Давайте труб воздух сухой, пока гранулы только сухой: гранулы должны по-прежнему сохраняют влажную внешний вид. Ресуспендируют каждая гранула в 70 мкл 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0. Пересушивания этих гранул может сделать их трудно ресуспендируют, или способными ввести в хлопьев и удаляйте со стороны трубки. Дополнительно: Скидка 15 мкл иммунопреципитации образец для будущего использования. Этот материал может использоваться для выполнения конкретных генов ПЦР подтверждение микрочипов результаты. Количественная концентрации УФ-поглощения (260 нм). Примечание: следующие шаги, включая подготовку библиотеки и усиление использовать модифицированную GenomePLex WGA комплект с 10X Mix Amp от Sigma без дНТФ: Библиотека подготовки Наличие в комплекте GenomePLex WGA с 10X Mix Amp от Sigma Добавить 2 мкл 1X буфера Подготовка библиотеки до 10 мкл образца ДНК из Очистка ДНК, шаг 11 в ПЦР-пробирку. Добавить 1 мкл Решение стабилизации библиотеки. Vortex тщательно, консолидировать центрифугированием, и место в термоциклер при 95 ° С в течение 2 минут. Охладите образцы на льду, консолидации путем центрифугирования с помощью центрифугирования, а затем вернуться на лед. Добавить 1 мкл ферментного препарата библиотека, вихревые тщательно, а затем центрифуги кратко. Место образца в термоциклер и инкубировать следующим образом: 16 ° С в течение 20 минут 24 ° С в течение 20 минут 37 ° C в течение 20 минут 75 ° C в течение 5 минут 4 ° C держать Удалить образцы термоциклер и центрифуги кратко. Пробы могут быть усилены сразу или хранить при температуре 20 ° С в течение трех дней. Усиление Наличие в комплекте GenomePLex WGA с 10X Mix Amp от Sigma Mix Master готовится путем добавления следующих реагентов к 15 мкл реакции Шаг 3, ниже: 7,5 мкл 10X Mix Amp (без дНТФ) 5,0 мкл полимеразы ДНК WGA 3,0 мкл 10 мМ дНТФ (каждый) акции (конечная концентрация 0,4 мм) Принесите окончательный объем реакционной смеси до 75 мкл с нуклеазы без воды Vortex тщательно. Центрифуга кратко, и начать термоциклирования. Первоначальные Денатурация 95 ° С в течение 3 минут Выполните 14 циклов следующим образом: Денатурировать 94 ° С в течение 15 секунд Отжиг / Удлинить 65 ° C в течение 5 минут После завершения езда на велосипеде, поддерживать реакции при 4 ° С и хранить при -20 ° С до готовности для анализа или очистки. Purify ДНК с очистки ПЦР ® Kit от Quiagen в соответствии с инструкциями изготовителя и количественно концентрации УФ-поглощения (260 нм). Выполните еще ​​раз цикл усиления из библиотеки Подготовка Шаг 1 до усиления, шаг 2, со следующими изменениями. • Что касается количества необходимых ДНК из Шаг 3, выше, инициировать процесс фрагментации: Если концентрация ДНК составляет около 200-300 мкг / мл, используйте 2,5 мкл образца и корректировать с водой для конечного объема 10 мкл. Если концентрация ДНК составляет около 50-60 мкг / мл, используйте 5 мкл образца и корректировать с водой для конечного объема 10 мкл. • В этот второй процесс усиления, дНТФ с dTTPs для мастер-микс обмен на сочетание в том числе 10 мМ дАТФ, 10 мМ дГТФ, 10 мМ дЦТФ и 8 мм dTTP и 2 мМ dUTP в той же концентрации, что предыдущий микс. Мера ДНК с использованием UV-VIS спектрофотометр (260 нм). Как правило, больше, чем 9 мкг амплифицированной ДНК получен из каждой реакции. NB: маркировка ДНК цели осуществляется с GeneChip ® WT двухцепочечной ДНК Терминал маркировки Kit от Affymetrix в соответствии с инструкциями производителя, как описано ниже: Фрагмент усиливается цели Фрагмент образцов с использованием соответствующей таблице ниже, в зависимости от того, что тип массива цель будет гибриднымized в. Таблица 1. Фрагментация Смесь для одного массива Том Компонентный / Сумма в 1 Rxn Двухцепочечной ДНК 7,5 мкг 10X кДНК Фрагментация 4,8 мкл UDG, 10 ед / мкл 1,5 мкл APE 1, 100 ед / мкл 2,25 мкл Нуклеазы без воды до 48 мкл Доступный в GeneChip ® WT двухцепочечной ДНК Терминал маркировки Kit от Affymetrix Таблица 2. Фрагментация Смесь для мульти-массив наборов Том Компонентный / Сумма в 1 Rxn Двухцепочечной ДНК 9 мкг 10X кДНК Фрагментация 4,8 мкл UDG, 10 ед / мкл 1,5 мкл APE 1, 100 ед / мкл 2,25 мкл Нуклеазы без воды до 48 Доступный в GeneChip ® WT двухцепочечной ДНК Терминал маркировки Kit от Affymetrix Настройка фрагментации смеси в соответствии с таблицами или выше. Флик-микс и спином вниз трубы. Инкубируйте реакции по адресу: 37 ° С в течение 1 ч. 93 ° С в течение 2 мин. 4 ° С в течение не менее 2 минут. Флик-микс, замедления вращения трубы, и передачи 45 мкл образца на новые трубы. Удалите 2 мкл каждого образца для гель-сдвиг анализа. Этикетка фрагментирован двухцепочечной ДНК Подготовка двухцепочечной ДНК маркировки Mix, как описано в таблице ниже: Таблица 3. Состав двухцепочечной ДНК Mix маркировки Том Компонентный / Сумма в 1 Rxn 5X TdT буфера 12 мкл TdT 2 мкл ДНК маркировки реагента, 5 мМ 1 мкл Общий объем 15 мкл Доступный в GeneChip ® WT двухцепочечной ДНК Терминал маркировки Kit от Affymetrix Добавить 15 мкл двухцепочечной Mix маркировки ДНК образцов ДНК, Флик-микс, и спина их вниз. Инкубируйте реакции по адресу: 37 ° С в течение 60 мин. 70 ° С в течение 10 мин. 4 ° С в течение 2 мин. Удалите 2 мкл каждого образца для гель-сдвиг анализа. Гель-сдвиг анализ Подготовка 4% агарозном геле. Инкубируйте образцы из фрагментов усиливается цели, шаг 5 и этикетка фрагментирован двухцепочечной ДНК, шаг 4 при 65 ° С в течение 2 мин. Добавьте 10 мкл стрептавидином (1 мг / мл), и инкубировать образцов при комнатной температуре в течение 5 мин. Выполнить образцы Шаг 3 на 4% агарозном геле (гель-анализа сдвиг, шаг 1) и проверить сдвиг миграции маркировки продукции. Гибридизации массива и массива стиральных Исполняет Геномная центр Калифорнийского университета Риверсайд. Массив анализ Исполняет численный анализ. BUFFER композиции: Блок Решение: PBS + 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Лизис буфера: 50 мМ HEPES-KOH, рН 7,5 140 мМ NaCl 1 мМ ЭДТА 1% Тритон Х-100 0,1% SDS 1mM PMSF Конечное значение рН 7,5 IP1: Лизис буфера + 500 мМ NaCl IP2: 10 мМ Трис-HCl 250 мМ LiCl 1 мМ ЭДТА 0,5% NP-40 0,5% натрия Dioxycholat Конечное значение рН 8,0 TE: 10 мМ Трис, рН 7,4 1 мМ ЭДТА Конечное значение рН 8,0 Элюции буфера: TE буфера + 1% SDS.

Discussion

Хроматин иммунопреципитации (чип) предлагает ценную технику для вскрытия хроматина основе процессов при клеточной дифференцировки. Предпосылки для успеха этого метода хорошие антитела и доступности хроматина из-под контроля клеток или тканей, которые не имеют антиген интереса. Объединив чип с ДНК-микрочипов технологии, огромные объемы информации могут быть получены. Проверка ChIP результатов зависит от наличия подходящих тест-системы, которая может связать динамические ассоциации белков, белковых модификаций и / или РНК, связанные с исполнением биологических процессов во время развития клеток.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Poteinase-K	Reagent	Roche	#EO0491
RNase-A	Reagent	Fermentas	#EN0531
formaldehyde 37%	Reagent	EMD	FX040-13
Chloroform	Reagent	EMD	3150
Ethanol	Reagent	Goldshield
phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Reagent	Invitrogen	15593-031
SA, fraction V	Reagent	EMD	2930
Dubecco’s Phosphate Buffered Saline	Reagent	Gibco	14190
HEPES	Reagent	EMD	5330
Sodium Chloride	Reagent	Fisher Scientific	S271-10
EDTA	Reagent	EMD	4050
Triton X-100	Reagent	EMD	9410
Sodium Dodecyl Sulfate	Reagent	J.T Baker	4095-02
Lithium chloride	Reagent	EMD	5910
Tris-HCl	Reagent	EMD	9230
NP-40	Reagent	Calbiochem	492015
Deoxycholic acid, sodium salt	Reagent	Fisher Scientific	BP349-100
Ammonium acetate	Reagent	Applichem	631-61-8
Glycine	Reagent	EMD	4840
Glycine	Reagent	EMD	4840
dynalbeads, protein A	Reagent	Invitrogen	100.02D
dynalbeads, protein G	Reagent	Invitrogen	100.04D
1.5ml Low Retention Microtubes, Xtreme	Other	Phenix Research Products	MAX-815S
Phase Lock Gel Light, 2.0 ml	Reagent	Eppendorf	955154037